阿魏酸對(duì)青貯主要有害微生物作用效果及機(jī)理研究

張微微， 馬 瑩， 袁 媛， 孫 星， 張 汆

（滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239000）

青貯飼料技術(shù)隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的快速發(fā)展已得到了廣泛的普及（盤道興等，2018）。 青貯飼料品質(zhì)直接受青貯中微生物的生長(zhǎng)情況調(diào)控，其中腐敗微生物會(huì)造成青貯飼料的腐敗變質(zhì)和經(jīng)濟(jì)損失，從而限制了青貯飼料的廣泛應(yīng)用（汪文忠，2017）。 梭菌、酵母菌、霉菌及意外引入的致病微生物是青貯飼料中主要的有害微生物群落， 不僅影響青貯品質(zhì)，還會(huì)對(duì)動(dòng)物的健康造成威脅（張秀麗和劉召乾，2020；倪奎奎，2016）。因此，為了進(jìn)一步提高青貯飼料的質(zhì)量，對(duì)抑制有害微生物生長(zhǎng)的有效舉措進(jìn)行不斷地探究。 多年來(lái)，通常直接向青貯飼料中添加抑菌劑，例如化學(xué)試劑、糖類、酶制劑等（王玉榮等，2017）。 而研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物，例如阿魏酸等具有抗菌、抑菌作用（張適等，2017）。

阿魏酸（Ferulic acid），在植物中普遍存在，其pH 相對(duì)穩(wěn)定，具有提高免疫力、抗菌消炎等效用，可被吸收也可被排出，幾乎無(wú)毒害性，在體內(nèi)也不會(huì)積累，可作為一種較佳的綠色飼料添加劑，在飼料中的應(yīng)用前景十分廣闊（宋凱等，2017）。海拉希等（2017）研究指出，阿魏酸可抑制大腸桿菌等致病菌及11 種引起食品腐敗微生物的生長(zhǎng)，且阿魏提取物在濃度為0.6%時(shí)對(duì)于青霉和黑曲霉的抑制效果比較顯著， 抑菌效果也隨著抑菌濃度的增加和觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而越發(fā)顯著。 阿魏酸可以抑制瘤胃中細(xì)菌、原蟲、真菌的生長(zhǎng)（Soberson 等，2012；Lou 等，2012；Akin，1982），但日糧中添加游離阿魏酸對(duì)奶牛的生產(chǎn)指標(biāo)沒(méi)有影響（Aguiar 等，2014；Sobern 等，2012）。 呂珍等（2012）研究認(rèn)為，阿魏酸可以通過(guò)使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞來(lái)抑制其生長(zhǎng)而達(dá)到抑菌作用，或者細(xì)菌N-乙酰轉(zhuǎn)移酶被阿魏酸抑制， 從而影響其合成而達(dá)到抗菌效果。宋凱等（2017）研究指出，阿魏酸能抑制與細(xì)菌和病毒生存相關(guān)酶的活性。

基于以上研究， 本試驗(yàn)旨在研究阿魏酸對(duì)青貯中主要微生物的作用效果， 通過(guò)研究阿魏酸對(duì)酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌的抑菌活性，檢測(cè)處理前后微生物生長(zhǎng)性能及菌體細(xì)胞形態(tài)等的變化，闡述抑菌效果，以此為阿魏酸作為天然安全的青貯抑菌劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌分離自玉米秸稈青貯， 保存于滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 材料與試劑 考馬斯亮藍(lán)G-250，南京杜萊生物有限公司；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；甲醇，廣州市信洪貿(mào)易有限公司；玉米秸稈青貯，實(shí)驗(yàn)室自制。

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)液： 用電子天平稱取0.6 g 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL 的甲醇溶液， 儲(chǔ)存于棕色容量瓶中。

1.3 主要儀器設(shè)備 分析天平（BSA124S）、生化培養(yǎng)箱（SPS-150B-Z）、水浴恒溫振蕩器（SHAB）、 高壓滅菌鍋（YXQ-LS-75SII）、 低速離心機(jī)（TG16-WS）、紫外分光光度計(jì)（UV745N）、電導(dǎo)率儀（DDB-303A）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 抑菌效果測(cè)定 濾紙片抑菌試驗(yàn)： 制備0.6%的阿魏酸溶液，滴加100 μL 至每片濾紙片，取0.1 mL 菌液于平板上，涂布均勻，放入三片加了阿魏酸的濾紙片， 中間放入加甲醇的濾紙片為對(duì)照，靜置5 min，放入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)后用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑（楊麗等，2018）。

1.4.2 抑菌曲線測(cè)定 依據(jù)史崇麗和繆錦來(lái)（2018）生長(zhǎng)曲線法測(cè)定阿魏酸對(duì)指示菌株生長(zhǎng)的影響。 所有處理組定點(diǎn)采樣， 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制抑菌曲線。

1.4.3 阿魏酸剩余含量的測(cè)定 采用比色法，以60%的甲醇作空白，在阿魏酸特定吸收峰320 nm下測(cè)定吸光度值， 依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出阿魏酸含量（蘇秀蘭和楊倚鱗，2016）。

阿 魏 酸 含 量/（μg/g）=（吸 光 度 值-0.0103）/0.0755×體積（50 mL）/樣品質(zhì)量（g）；

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)工作方程為Y=0.0755X+0.0103。

1.4.4 微生物胞外蛋白的測(cè)定 依據(jù)聶昌宏等（2019）方法將阿魏酸處理的菌懸液與對(duì)照組置于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)采樣，取1 mL 待測(cè)樣，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)顯色劑，靜置10 min，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.5 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 將阿魏酸處理的菌懸液與對(duì)照組于對(duì)應(yīng)菌株培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)， 定時(shí)（0、12、24 h）采樣，測(cè)定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率（Karthikeyan等，2016）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈大小 濾紙片法可以直觀地揭示阿魏酸對(duì)于指示菌株有無(wú)抑菌效應(yīng)， 其抑菌效果見(jiàn)表1。 0.6%的阿魏酸對(duì)四種指示菌株均具有抑菌活性，效果較為明顯。 對(duì)酵母菌、丁梭菌、乙酸菌、霉菌的抑菌圈直徑分別為10.41、9.12、8.66、

10.34 mm。 在濃度為0.6%的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)液處理下，酵母菌和霉菌的抑菌圈直徑較大，抑制效果顯著優(yōu)于其他兩種指示菌株。

表1 抑菌圈直徑 mm

2.2 阿魏酸對(duì)指示菌株的抑菌曲線 生長(zhǎng)曲線可以反映微生物的生長(zhǎng)與時(shí)間的關(guān)系。 用生長(zhǎng)曲線法測(cè)出的抑菌曲線可以通過(guò)直觀的比較揭示指示菌株的生長(zhǎng)規(guī)律與阿魏酸的抑菌能力情況。 菌株的抑菌曲線如圖2。 經(jīng)阿魏酸處理的各指示菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)均弱于對(duì)照組， 研究結(jié)果與Soberon等（2012）報(bào)道一致。酵母菌生長(zhǎng)總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但阿魏酸處理組總趨勢(shì)均弱于對(duì)照組； 丁梭菌0 ～2 h 處于適應(yīng)期， 速度增長(zhǎng)緩慢，2 h 之后慢慢進(jìn)入對(duì)數(shù)期，增長(zhǎng)速度加快，但阿魏酸處理組緩慢增長(zhǎng)并于22 h 進(jìn)入穩(wěn)定期； 乙酸菌0 ～5 h 為停滯期，培養(yǎng)8 h 后，對(duì)照組9 h 達(dá)到頂峰，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，而阿魏酸處理組一直處于抑制狀態(tài)，無(wú)增長(zhǎng)；霉菌由于培養(yǎng)周期長(zhǎng)，0 ～24 h 處于緩慢增長(zhǎng)狀態(tài)，而阿魏酸處理組趨勢(shì)明顯弱于對(duì)照組。由此可推斷，阿魏酸能抑制指示菌株的生長(zhǎng)，使其未能形成對(duì)數(shù)高峰期。

圖2 抑菌曲線

2.3 阿魏酸剩余含量的測(cè)定 菌株對(duì)阿魏酸的利用能力見(jiàn)圖3，在酵母菌、丁梭菌、乙梭菌、霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中， 阿魏酸持續(xù)被消耗， 作用于指示菌株，抑制其生長(zhǎng)。

圖3 阿魏酸剩余含量

2.4 阿魏酸對(duì)胞外蛋白含量的影響 利用考馬斯亮藍(lán)G-250 在酸性條件下和蛋白質(zhì)結(jié)合的原理， 進(jìn)行可溶性蛋白含量的測(cè)定。 試驗(yàn)結(jié)果如圖4。 各指示菌株胞外蛋白含量總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在含有阿魏酸的試驗(yàn)組， 胞外蛋白的含量在試驗(yàn)期間內(nèi)均低于對(duì)照組，結(jié)果與呂珍等（2013）相同。阿魏酸處理后，由于菌體處于不利環(huán)境，為了抵御環(huán)境正常生長(zhǎng)， 菌體處于脅迫狀態(tài)下會(huì)將合成蛋白用于修復(fù)損傷部位，提高生存率，加之此時(shí)阿魏酸可能與相關(guān)酶進(jìn)行結(jié)合會(huì)影響相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，使其不能及時(shí)修復(fù)相關(guān)損傷部位， 隨之細(xì)胞膜的完整性不斷遭到破壞，菌體大量裂解死亡，導(dǎo)致胞外蛋白含量低于對(duì)照組。經(jīng)阿魏酸處理后，酵母菌試驗(yàn)組胞外蛋白含量降低了16.4%， 丁梭菌試驗(yàn)組胞外蛋白含量降低了6%， 乙酸菌試驗(yàn)組胞外蛋白含量降低了8.2%，霉菌試驗(yàn)組胞外蛋白含量降低了10.8%。 相比細(xì)菌類阿魏酸對(duì)于真菌類的抑制效果更為明顯。

圖4 胞外蛋白的變化

2.5 相對(duì)電導(dǎo)率 液體培養(yǎng)基中的電導(dǎo)率一般隨著培養(yǎng)的進(jìn)行而降低， 培養(yǎng)液體系的電導(dǎo)主要由液體中電解質(zhì)影響（Katrhikeyan 等，2016；Trang等，2009），結(jié)果如表2。 指示菌株的生長(zhǎng)狀況與培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)相反， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率隨之下降，試驗(yàn)組相較于對(duì)照組均有降低， 說(shuō)明阿魏酸影響了指示菌株對(duì)培養(yǎng)基的利用能力， 對(duì)各指示菌株均具有抑制作用。 樊新民等（2006）與雒江菡等（2020）研究表明，菌株的生長(zhǎng)情況與培養(yǎng)液的電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)， 隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，電導(dǎo)率不同程度的下降，從而證明了本試驗(yàn)結(jié)果的可信。 在0 時(shí)刻電導(dǎo)率不一致的原因可能是不同菌株初始時(shí)刻對(duì)于阿魏酸的耐受能力有所不同。 培養(yǎng)過(guò)程中，阿魏酸作用使得丁梭菌和乙酸菌兩種細(xì)菌菌體的細(xì)胞膜通透性改變，內(nèi)有細(xì)胞內(nèi)容物流出，改變了培養(yǎng)基的電導(dǎo)率，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，沒(méi)有死掉的菌體生長(zhǎng)消耗了培養(yǎng)液中的無(wú)機(jī)鹽類，電導(dǎo)率繼而又會(huì)有不同程度的降低，而且細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞膜的通透性程度與阿魏酸濃度相關(guān)。

表2 處理組電導(dǎo)率的變化 us/cm

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸對(duì)青貯中酵母菌、丁梭菌、乙酸菌和霉菌均具有較為強(qiáng)烈的抑制作用。 其抑菌機(jī)理可能與延長(zhǎng)指示菌株的適應(yīng)期， 破壞蛋白質(zhì)的合成，影響指示菌株對(duì)培養(yǎng)基的利用能力，干擾菌株生理代謝活動(dòng)有關(guān)。綜上所述，阿魏酸對(duì)青貯中主要有害微生物均有抑制作用， 但阿魏酸作為青貯抑菌劑，是否影響青貯品質(zhì)，還需進(jìn)一步深入研究。