加味茵陳五苓散對(duì)非酒精性脂肪肝模型大鼠miR-34a及糖異生的影響*

鄭丁，時(shí)昭紅，郭潔，張書(shū)，劉云，張曼玲

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430022）

迄今，非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）發(fā)展為世界上最常見(jiàn)的肝病，全球NAFLD總患病率高達(dá)25.24%，其中中東和南美國(guó)家的發(fā)病率最高（約30%），而非洲的研究報(bào)告的發(fā)病率最低（約13%）[1]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及飲食結(jié)構(gòu)改變，NAFLD的發(fā)病率逐年增加，尤其在亞洲增長(zhǎng)更為明顯[2-3]。在過(guò)去10年間，中國(guó)NAFLD的流行率增加了兩倍，其中上海更是（2003—2016年）從12.9%上升到43.3%[4]。NAFLD不僅僅是肝臟的疾病，而是全身代謝性疾病的中介，與高血壓病、糖尿病等密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅人類健康。目前NAFLD的治療僅局限于飲食控制及運(yùn)動(dòng)，但是患者往往很難堅(jiān)持目前生活方式的改變。因此，尋求藥物治療NAFLD是提高臨床療效的迫切要求。肝臟糖異生與NAFLD發(fā)生密切相關(guān)，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是糖異生關(guān)鍵酶，PEPCK表達(dá)異?？梢哉T發(fā)NAFLD。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（PGC-1α）可激活多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控肝糖異生[5]。在前期實(shí)驗(yàn)中，筆者課題組也發(fā)現(xiàn)PGC-1α可影響PEPCK的表達(dá)[6]。miR-34a是脂肪細(xì)胞分泌的微小miRNA，研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a能夠下調(diào)PGC-1α的表達(dá)[7]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療NAFLD中取得了較好的療效，茵陳五苓散出自張仲景的《金匱要略》，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其治療NAFLD療效很好[8]，在前期總結(jié)時(shí)昭紅教授臨床運(yùn)用茵陳五苓散加減治療脂肪肝也取得較顯著的效果，但作用機(jī)制尚不明確。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，由湖北省疾病控制中心提供。

1.2 材料 加味茵陳五苓散組成：茵陳20 g，豬苓15 g，茯苓 15 g，澤瀉 15 g，白術(shù) 15 g，桂枝 10 g，白扁豆10 g，炒麥芽15 g，生山楂15 g，陳皮10 g。生山楂可消食健脾胃，助脾恢復(fù)健運(yùn)，又可活血化瘀；炒麥芽疏肝氣，又能健脾導(dǎo)滯；陳皮具有祛濕、健脾、化痰之功，與白術(shù)同用可補(bǔ)脾，與茯苓同用則有祛濕的作用；白扁豆能補(bǔ)能舒，故補(bǔ)而不滯也，加用白扁豆，助白術(shù)、茯苓健脾祛濕，恢復(fù)脾運(yùn)化功能。

高脂飼料包括83%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油+5%蔗糖。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥 全部實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)取10只作為正常組，余40只作為實(shí)驗(yàn)組，正常組給予普通飼料，實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料喂養(yǎng)，8周后通過(guò)肝組織病理蘇木精-伊紅（HE）染色確定造模成功后。隨機(jī)分為模型組、中藥組、中藥+空載體病毒組、中藥+慢病毒組，所有大鼠按之前飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。正常組和模型組均給予3 mL生理鹽水灌胃和200 μL生理鹽水尾靜脈注射；中藥組給予3 mL加味茵陳五苓散灌胃和200 μL生理鹽水尾靜脈注射，中藥+空載體病毒組給予3 mL加味茵陳五苓散灌胃和200 μL慢病毒尾靜脈注射；中藥+慢病毒組給予3 mL加味茵陳五苓散灌胃和200 μL miR-34a慢病毒尾靜脈注射；每日1次，連續(xù)4周。

2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 最后1次灌胃后禁食禁水12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（10 mL/kg）抽取腹主動(dòng)脈血約5 mL，1 370×g離心10 min分離上層血清分裝，放-20℃冰箱保存，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平。另取肝左外側(cè)葉距邊緣1 cm處取適量大小的肝組織兩塊，分別放入福爾馬林中固定和離心管中放入-20℃冰箱保存。

2.3 肝組織miR-34a、PGC-1α、PEPCK的表達(dá) 采用Trizol提取RNA后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)。PCR 引物設(shè)計(jì)：RatPGC-1αF：5’-AATGCAGCGGTCTTAGCACT-3，RatPGC-1αR：5’-GTGTGAGGAGGGTCATC，片段長(zhǎng)度 168 bp；miR-34aF5’-TCGTGACTGGGATGCTGC-3’，R5’-TCGGCATGCATTGATTGC-3’，片段長(zhǎng)度 158 bp；PEPCKF5’-GCAGCGGTCGAGGATGA-3’，R5’-AACCTCTATGACGGAG-3’，片段長(zhǎng)度 145 bp；β-actinF：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，β-actin R：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’片段長(zhǎng)度186 bp。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性50℃2 min，95℃10 min；40個(gè)循環(huán)中95℃30 s，60℃30 s，根據(jù)目的產(chǎn)物PGC-1α mRNA和內(nèi)參照β-actin CT值來(lái)反映其相對(duì)含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化 HE染色鏡下觀，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細(xì)胞大小適中、肝細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯異常，肝細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)脂肪空泡；模型組及中藥+慢病毒組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞增大、排列紊亂，肝細(xì)胞可見(jiàn)大量大小不等脂肪空泡；中藥組及中藥+空載體病毒組肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞大小、形態(tài)未見(jiàn)明顯異常，肝細(xì)胞偶見(jiàn)少量脂肪空泡。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝脂肪變性程度Fig.1 Degree of hepatic steatosis of rats in each group

3.2 各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平 模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平均高于正常組，給予中藥干預(yù)后，中藥組血清ALT、AST、TC、TG水平均低于模型組，慢病毒過(guò)表達(dá)miR-34a后，中藥+慢病毒組大鼠與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），中藥+空載體病毒組血清ALT、AST、TC、TG表達(dá)水平較模型組均降低（P＜0．05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平Tab.1 Serum ALT，AST，TC，TG levels of rats in each group

3.3 各組大鼠肝臟細(xì)胞miR-34a、PGC-1α、PEPCK mRNA的表達(dá) 模型組miR-34a mRNA表達(dá)水平高于正常組，PGC-1α、PEPCK mRNA的表達(dá)低于正常組（P＜0．05）；給予中藥干預(yù)后，中藥組 miR-34a的表達(dá)明顯低于模型組，PGC-1α、PEPCK mRNA的表達(dá)高于模型組。慢病毒過(guò)表達(dá)miR-34a后，中藥+慢病毒組 miR-34a、PGC-1α、PEPCK mRNA 的表達(dá)較模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；與模型組比較，中藥+空載體病毒組的miR-34a mRNA表達(dá)明顯降低，PGC-1α、PEPCKmRNA 的表達(dá)明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同組別大鼠miR-34a、PGC-1αand PEPCK mRNA的表達(dá)Tab.2 The mRNA expressions of miR-34a，PGC-1αand PEPCK of rats in different groups

4 討論

MicroRNA（miRNA）是一種能夠調(diào)控下游基因的短鏈非編碼RNA，廣泛參與機(jī)體生理和病理過(guò)程[9]。肝細(xì)胞脂肪蓄積以及肝細(xì)胞的炎性破壞具有很強(qiáng)的遺傳性，因此NAFLD的發(fā)生和進(jìn)展也受到表觀遺傳因素的調(diào)控。其中miRNA通過(guò)與許多互補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄后水平在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮很大作用，其失調(diào)已被證明大量實(shí)驗(yàn)研究表明miRNA的表達(dá)異常對(duì)NAFLD具有較高的預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值[10-11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，脂質(zhì)沉積是NAFLD發(fā)生的關(guān)鍵因素[12]。miRNA在肝臟脂質(zhì)沉積中發(fā)揮重要作用[13]。目前，大量研究證實(shí)miR-34a在NAFLD中肝細(xì)胞中表達(dá)異常，提示miR-34a可能是NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要因子[14]。在本次實(shí)驗(yàn)研究中，模型組大鼠肝臟miR-34a的表達(dá)明顯高于正常組大鼠。

PEPCK是糖異生關(guān)鍵酶，參與調(diào)節(jié)肝臟糖異生，下調(diào)PEPCK的表達(dá)可抑制肝臟糖異生[15]。在前期實(shí)驗(yàn)研究中，本課題組證實(shí)提高PGC-1α的含量能夠激活PEPCK的表達(dá)[16]。在本次研究中，模型組中PGC-1α和PEPCK的表達(dá)均明顯低于正常組，通過(guò)加味茵陳五苓散干預(yù)后，提高PGC-1α的表達(dá)后，PEPCK的表達(dá)也增加。

中醫(yī)認(rèn)為，“痰”“瘀”乃NAFLD的關(guān)鍵病理因素，痰瘀之邪漸積于肝，久不得散則痞塊乃成肝癖，治療上通常以“祛痰降濁、活血化瘀”為則，但臨床上部分患者療效仍不盡理想。葉天士認(rèn)為陽(yáng)氣不通乃痰濁、瘀血停聚的根本病機(jī)，于是提出“陽(yáng)氣窒閉，濁陰凝瘡”。辛溫通陽(yáng)之品易助熱，對(duì)于濕熱之證，葉天士采用利小便去濕，濕去則熱孤，陽(yáng)氣則通。本研究中，中藥組miR-34a表達(dá)明顯低于模型組以及PGC-1α和PEPCK的表達(dá)高于模型組，說(shuō)明加味茵陳五苓散能降低大鼠miR-34a的表達(dá)和促進(jìn)PGC-1α和PEPCK的表達(dá)。使用慢病毒過(guò)表達(dá)miR-34a后，中藥+慢病毒組miR-34a、PGC-1α和PEPCK的表達(dá)與模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-34a后，加味茵陳五苓散不能發(fā)揮改善肝脂肪變性的作用，而中藥+空載體病毒組miR-34a、PGC-1α和PEPCK的表達(dá)與中藥組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明加味茵陳五苓散通過(guò)降低miR-34a的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PGC-1α和PEPCK的表達(dá)。

綜上所述，加味茵陳五苓散能夠通過(guò)降低miR-34a的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)PGC-1α、PEPCK的表達(dá)，促進(jìn)糖異生，減少肝臟脂質(zhì)沉積，以改善NAFLD肝細(xì)胞脂肪變性。