基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子作用機(jī)制

★吳成成 黃海鵬 羅文兵（.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 0006；.新余市中醫(yī)院 江西 新余 8000；.分宜縣中醫(yī)院 江西 分宜 6600）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不十分清楚的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病變多位于乙狀結(jié)腸和直腸，病程較長、亦反復(fù)發(fā)作，且部分患者最終可能發(fā)展成結(jié)直腸癌，目前其發(fā)病率在我國呈持續(xù)上升趨勢［1］。西醫(yī)治療該病尚無特效藥，以對癥治療為主，部分西藥因存在肝腎損傷、患者依從性差等原因，導(dǎo)致臨床療效不佳［2-3］。中藥葛根芩連湯治療該病由來已久，臨床效果較好，但其具體作用機(jī)制目前尚未完全清楚。因此，探討該方治療UC的具體分子機(jī)制對其臨床治療、運(yùn)用具有重要意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是2007年提出的一種用系統(tǒng)生物學(xué)方法來進(jìn)行藥理學(xué)研究的新型技術(shù)方法，是基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)，能系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，這與中藥復(fù)方的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理相似［4-5］。因此，本文采用該方法對葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 方法

1.1 藥物成分及靶點(diǎn)的查詢及篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以O(shè)B≥30 %或DL≥0.18為閾值對葛根芩連湯中藥物成分進(jìn)行篩選［6］。將篩選后的化合物輸入BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中，以得分（Score）≥20與調(diào)整P值（Adjusted P-value）＜0.05為臨界值進(jìn)行藥物靶標(biāo)的篩選［7］。

1.2 UC相關(guān)基因的檢索 在數(shù)據(jù)庫DisGeNET［8］（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）中輸入潰瘍性結(jié)腸炎名稱，查找與其相關(guān)的疾病基因。

1.3 葛根芩連湯治療UC的靶標(biāo)蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析及網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建 將葛根芩連湯預(yù)測所得的基因與UC基因進(jìn)行映射，得出該方治療UC的作用基因，并將其輸入STRING數(shù)據(jù)庫［9］進(jìn)行PPI分析。在分析過程中，選取PPI得分大于0.4的基因輸入Cytoscape軟件（3.2.1）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。應(yīng)用軟件中的Network Analysis plugin對網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)（Node）進(jìn)行統(tǒng)計，分析其在圖中的作用——自由度（Degree）。自由度越大，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的生物功能則越多。以Degree大小對節(jié)點(diǎn)顏色進(jìn)行渲染，從黃色漸變到紅色，黃色代表該節(jié)點(diǎn)自由度較小，紅色代表該節(jié)點(diǎn)自由度較大。

1.4 基因本體（Gene Ontology，GO）、KEGG PATHWAY通路富集 將上述所得的作用基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）［10］進(jìn)行GO、KEGG分析，以調(diào)整P值＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.5 葛根芩連湯治療UC“成分-靶標(biāo)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將葛根芩連湯中有效的作用成分、其作用靶標(biāo)、信號通路輸入Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建“成分-靶標(biāo)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎潛在靶標(biāo) 基于DisGeNET數(shù)據(jù)庫查詢所得，有914個基因與UC相關(guān)。通過TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選后發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯治療UC的作用基因有155個，有效成分有127個。

2.2 葛根芩連湯治療UC“蛋白-蛋白”相互作用圖 由圖1可知，有153個節(jié)點(diǎn)符合條件，聚類系數(shù)為0.555，網(wǎng)絡(luò)密度為0.169。運(yùn)用CytoHubba軟件根據(jù)節(jié)點(diǎn)自由度大小進(jìn)行排列，挑選前10個作為葛根芩連湯治療UC的關(guān)鍵蛋白，見圖2及表1。

2.3 葛根芩連湯治療UC作用基因的KEGG PATHWAY通路富集 用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線通路富集，經(jīng)過篩選后有21個通路，其中包括NF-kB、HIF-1、NOD樣受體等信號通路，見圖3。

2.4 葛根芩連湯治療UC作用基因GO分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析，最終得出：其生物過程（biological process, BP）主要集中在細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)、防御反應(yīng)等幾個方面，細(xì)胞組成（cellular component，CC）主要集中在細(xì)胞表面、細(xì)胞外部分、質(zhì)膜外側(cè)面等，分子功能（Molecular Function，MF）主要表現(xiàn)在受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性等，見表2。

2.5 葛根芩連湯治療UC“重要成分-靶標(biāo)”圖 將葛根芩連湯中有效成分、靶基因輸入Cytoscape 3.2.1軟件中，以Degree≥5為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選構(gòu)建“重要成分-靶標(biāo)”圖。圖中紅色棱形節(jié)點(diǎn)代表作用基因，黃色圓形節(jié)點(diǎn)代表藥物中的小分子化合物，見圖4。

圖1 葛根芩連湯治療UC中PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 葛根芩連湯治療UC中PPI關(guān)鍵基因

圖2 葛根芩連湯治療UC中PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因

圖3 葛根芩連湯治療UC的通路富集圖

表2 GO分析結(jié)果

圖4 葛根芩連湯治療UC“重要成分-靶標(biāo)”圖

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎在中醫(yī)學(xué)中屬“泄瀉”“痢疾”“腸癖”等范疇，多因濕熱壅滯腸道而致下利膿血。葛根芩連湯源自《傷寒論》，君藥葛根辛甘而涼，入脾胃經(jīng)，既能解表退熱，又能升脾胃清陽之氣而治下利；黃連、黃芩清熱燥濕、厚腸止利；甘草可調(diào)和諸藥，此方為表里雙解劑，有治下利的作用，臨床用于治療UC療效佳，然其具體作用機(jī)制尚不完全清楚［11］。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其進(jìn)行探討。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯中有127個有效成分可用于治療UC，其中作用的靶基因有155個、分子信號通路22個。從 PPI分析可見，該方作用的關(guān)鍵靶基因?yàn)槟[瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、白介素2（interleukin-2，IL-2）、白介素10（interleukin-10，IL-10）等， 這與之前文獻(xiàn)報道相符［12-14］。TNF與IL-6、IL-10、IL-2均是炎癥介質(zhì)的一種。UC發(fā)病原因尚不明確，普遍認(rèn)為與感染、遺傳、免疫等因素相關(guān)。UC患者臨床癥狀大多表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)，腸組織中多有炎性細(xì)胞浸潤，炎癥反應(yīng)為認(rèn)為是該病發(fā)病機(jī)制中最重要的因素之一［15］。TNF、IL-1β、IL-6、IL-10等炎性細(xì)胞因子可使中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腸壁聚集，導(dǎo)致腸黏膜上的炎癥反應(yīng)放大，促進(jìn)促炎因子的分泌，形成級聯(lián)炎癥反應(yīng)，加重腸道炎癥的發(fā)展［16］。葛根芩連湯作用的22個信號通路中包括NF-kB、HIF-1、NOD樣受體等信號通路，其中NF-kB通路是UC發(fā)病過程中腸道炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，可調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的多種基因［17］；HIF-1為缺氧誘導(dǎo)因子，與腸道粘膜屏障功能的維持、修復(fù)及免疫炎癥等相關(guān)，多有研究報道其在UC發(fā)病中常呈上調(diào)狀態(tài)［18］；NOD樣受體屬天然免疫系統(tǒng)，其參與細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原體相關(guān)分子模式的識別并可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，長期功能失調(diào)可導(dǎo)致慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等的發(fā)生［19］。目前已有文獻(xiàn)報道該方對NF-kB具有調(diào)節(jié)作用［13］，然對HIF-1、NOD樣受體信號通路的影響尚未可知，此將作為本課題組后續(xù)的研究方向之一。