基于網(wǎng)絡藥理學的建昌幫姜天麻對偏頭痛作用機制研究

★謝宇璐 葉慧 張霞 李家榮 陳海香 葉喜德 彭巧珍（.江西中醫(yī)藥大學 南昌0004；2.萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院 江西 萍鄉(xiāng) 7000；.南昌航空大學 南昌 006）

天麻為蘭科植物天麻G. elataBI. 的干燥塊莖［1］，春、冬季節(jié)采挖，其味甘性平，專入肝經(jīng)，為肝風內動之常用藥，又為“偏頭痛”之要藥，無論寒熱虛實均可配伍應用。中醫(yī)常以天麻單用或隨證配伍用于治療頭痛眩暈、癲癇、小兒驚風等證［2］。姜天麻為江西“建昌幫”特色飲片之一［3］，辛溫之生姜炮制天麻，可增強天麻鎮(zhèn)痛、抗眩暈之效，但對偏頭痛的作用機制，目前文獻仍屬空白。偏頭痛，是一種以單側或雙側搏動性中至重度頭痛為特征的慢性神經(jīng)血管性疾病，發(fā)病時并伴有自主神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［4］。其病機復雜，至今尚未有一致的解釋。目前普遍認同的學說有三叉神經(jīng)血管、血管源學說和神經(jīng)和炎癥介質等學說［5］。近年來基因遺傳學說、中樞神經(jīng)系統(tǒng)學說也被相繼提出［6］。

網(wǎng)絡藥理學是一門基于系統(tǒng)生物學與計算機技術發(fā)展起來的新興學科，在系統(tǒng)生物學、多向藥理學等多個學科理論基礎上，運用文本數(shù)據(jù)挖掘、代謝組學和網(wǎng)絡可視化技術，系統(tǒng)觀察藥物對于靶點和疾病網(wǎng)絡的干預以及影響，從而揭示多分子藥物協(xié)同作用對疾病作用機理［7］。而中藥及中藥復方治療疾病具有多成分、多靶點、多途徑等特點，契合網(wǎng)絡藥理學特點。課題組前期圍繞姜天麻炮制前后成分變化進行了研究，并鑒定出20個主要差異性成分［8］。為此，本研究依照這些差異性成分，通過網(wǎng)絡分析平臺，構建藥物-成分-靶點-偏頭痛關系網(wǎng)，以推測天麻炮制對偏頭痛作用機制，為姜天麻臨床應用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 軟件及數(shù)據(jù)庫 軟件：Cytoscape 3.6.1軟件、R語言統(tǒng)計建模軟件（version 3.6.2）、perl腳本解釋器ActivePerl（version 5.26.1.2601）。

數(shù)據(jù)庫：Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www. Swisstargetprediction. ch/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）、Genencards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、KEGG數(shù) 據(jù) 庫（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）、Drug Bank數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）。

1.2 方法

1.2.1 姜天麻炮制差異性成分的收集 基于前期已分析出天麻炮制后20個主要差異性成分為研究對象。

1.2.2 成分作用靶點預測 通過Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫畫出化合物結構后進行體內作用靶點預測，并篩選物種為“人”的潛在靶點。

1.2.3 偏頭痛靶點收集 通過Genencards數(shù)據(jù)庫，輸入關鍵詞“migraine”查找相關的疾病作用靶點，并通過OMIM、DisGeNET等數(shù)據(jù)庫驗證。

1.2.4 藥物成分靶點與疾病靶點交集 將20種差異性成分的靶點與偏頭痛相關基因進行映射，得到成分作用于偏頭痛潛在靶點，并制成表格，以供構建網(wǎng)絡使用。

1.2.5 網(wǎng)絡構建 據(jù)“1.2.3”和“1.2.4”的結果，在EXCEL表格中建立藥物-化合物、化合物-靶點、靶點-疾病的相互對應關系，在Cytoscape 3.6.1軟件中導入network構建網(wǎng)絡［9］，再導入type文件，調整網(wǎng)絡并完善，得“姜天麻-差異性成分-靶點-偏頭痛”網(wǎng)絡圖，如圖1。再運用其插件Network Analyzer計算網(wǎng)絡特征，網(wǎng)絡中節(jié)點（node）表示疾病、藥物、化合物、靶點，邊（edge）表示疾病-靶點、化合物-靶點以及藥物-化合物之間的相關關系。

1.2.6 生物過程和通路分析 靶點GO功能分析基于R語言統(tǒng)計建模軟件（clusterProfiler包），對潛在作用靶點進行GO注釋和KEGG通路富集分析（p值為0.05，q值為0.05），并將結果以氣泡圖形式輸出［10］，如圖2、3。

圖1 網(wǎng)絡藥理圖

圖2 GO功能分析氣泡圖

圖3 KEGG富集分析氣泡圖

2 結果

2.1 偏頭痛靶點收集 經(jīng)Genencards數(shù)據(jù)庫收集“migraine”相關的疾病作用靶點，因偏頭痛相關靶點過多，故篩選出得分≥1的靶點，總計2 150個。

2.2 藥物成分靶點與疾病靶點交集 通過“1.2.4”的靶點映射，在20種差異性成分中找到150個治療偏頭痛潛在作用靶點，如TNF、EDNRA、ESR1、HTR1B、ACE、DRD2、HTR2A等。其中在“1.2.5”項下構建的網(wǎng)絡圖中degree值前十分別是ADORA1、CYP19A1、TERT、SRD5A1、ESR1、TYMS、SLC6A2、LGALS3、EPHX2、HSP90AA1，見表1。

表1 度值前十的基因

2.3 網(wǎng)絡拓撲學屬性分析 對姜天麻差異性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡的拓撲屬性分析發(fā)現(xiàn)，構建網(wǎng)絡的節(jié)點度服從冪律分布，提示其符合生物網(wǎng)絡一般特性［11］，聚集系數(shù)(Clustering Coefficient)為0，網(wǎng)絡中心度(Network centralization )0.809，網(wǎng)絡異質性(Network heterogeneity)為1.354，平均相鄰節(jié)點數(shù)目(Avg. number of neighbors)13.186，特征路徑長度(Characteristic path length)2.061，即網(wǎng)絡路徑長度為2步，說明整個網(wǎng)絡具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 生物過程和通路分析 GO功能分析結果主要涉及amide binding(酰胺結合）、peptide binding（肽結合)、G protein-coupled amine receptor activity(g蛋白偶聯(lián)胺受體活性）、catecholamine binding（兒茶酚胺結合)、endopeptidase activity(內肽酶活性）等148個條目。KEGG 富集分析共映射出17條信號通路（如表2）。其中靶點數(shù)排名前五的分別是神經(jīng)活性配體-受體相互作用、Ca2+信號通路、cAMP信號通路、缺氧誘導因子-1信號通路、內分泌阻力等。而EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、內分泌抵抗、鉑耐藥性等通路與腫瘤、癌癥相關。

表2 KEGG通路信息圖

3 討論

偏頭痛生理病理過程復雜，涉及血管、神經(jīng)、免疫、炎癥介質、基因遺傳、腦結構和功能異常等［12］。本研究發(fā)現(xiàn)姜制天麻后20個主要差異性成分，對偏頭痛的作用存在150個潛在靶點，其中TNF、MAOB、MAOA、ACE、TRPV1、PTGS2、NOS2、MMP9、HTR2C、HTR2B、HTR2A、HTR1B、PIK3CA、PRKCG、PRKCA、VEGFA等基因，均與偏頭痛的病理生理過程密切相關。偏頭痛在發(fā)病期間，體內TNF、MMP9、PKC、NO水平明顯偏高。蛋白激酶C（PKC）屬于絲氨酸和蘇氨酸激酶，PKC的激活是介導腦損傷的關鍵環(huán)節(jié)［13］，通過抑制PKC水平可明顯緩解偏頭痛［14］。NO增多會擴張血管并引起神經(jīng)源性炎癥反應，引發(fā)血管擴張性頭痛，一氧化氮合酶（NOS）可介導內源性NO的合成［15］，同時，NOS抑制劑可明顯緩解偏頭痛癥狀［16］。5-羥色胺（5-HT）含量升高，會引發(fā)腦血管收縮，為偏頭痛發(fā)病的關鍵原因。瞬時感受器電位香草酸受體（TRPV1）多表達于神經(jīng)細胞膜上，在誘發(fā)炎性疼痛過程中作用顯著［17］，這其中的原因，可能是由于激活了巨噬細胞系統(tǒng)，而釋放5-HT、PGE、BK及CCL2等介質，參與偏頭痛發(fā)?。?8］。血管緊張素轉換酶(ACE )是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的關鍵酶，可將血管緊張素Ⅰ（Ang Ⅰ）轉換為血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）［19］，后者可收縮血管和升高血壓，參與偏頭痛發(fā)作。AngⅡ受體阻滯劑和ACE 抑制劑能較好預防偏頭痛發(fā)作［20］?；|金屬蛋白酶9（MMP9）可損壞血腦屏障，造成腦出血和腦水腫，且對神經(jīng)元有一定毒副作用［21］，MMP9也是引發(fā)炎癥反應的重要物質。前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2 ）是前列腺素生物合成的核心酶，前列腺素是偏頭痛的重要致痛因子，其可能的作用機制是擴張腦血管［22］。研究發(fā)現(xiàn)降低PTGS2基因的表達量，可減少體內前列腺素的合成，從而緩解腦血管的擴張過度，消除神經(jīng)源性炎癥從而達到治療無先兆型偏頭痛的目的［23］。

姜天麻差異性成分中存在多巴胺受體（DRD1、DRD2、DRD3、DRD4）與 阿 片 受 體（OPRM1、OPRK1、OPRD1）以及腺苷A1受體（ADORA1）、核因子κB激酶亞單位β抑制劑（IKBKB）、第一類5-羥色胺受體（5-HTR1A、5-HTR1）等基因，這些基因可作用于多種信號通路產生鎮(zhèn)痛作用。經(jīng)KEGG通路富集分析，姜天麻差異性成分主要通過鈣信號通路、cAMP信號通路、花生四烯酸代謝、血管內皮生長因子信號通路等通路作用。根據(jù)血管源學說，炎癥介質的產生，是偏頭痛病理生理基礎。作用于內皮細胞上的CGRP受體，可通過cAMP通路增加細胞內Ca2+濃度，上調NOS產生NO致平滑肌舒張；同時CGRP 還可經(jīng)前列環(huán)素（PGI2）作用，活化cAMP/蛋白激酶A（PKA）通路從而達到舒張血管的目的［24］?；ㄉ南┧岽x能影響疼痛的產生，環(huán)氧合酶作用后，其代謝產物PGE1、PGE2 及PGE3加強痛覺感受器對致痛物質的敏感性［25］。姜天麻差異成分的潛在靶點結果顯示，差異性成分可通過作用7個靶點（PTGS2、PTGS1、TBXAS1、PLA2G2A、ALOX5、EPHX2、PLA2G4A）進而影響花生四烯酸的代謝。

4 總結

本實驗網(wǎng)絡藥理結果表明，姜天麻差異性成分可以與TNF、MAOB、MAOA、ACE、ADORA2A、TRPV1、PTGS2、NOS2、MMP9、HTR2C、HTR2B、HTR2A、HTR1B、PIK3CA、PRKCG、PRKCA、VEGFA、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、OPRM1、OPRK1、OPRD1、ADORA1、IKBKB、5-HTR1A、5-HTR1等相關靶點結合，通過Ca2+和cAMP信號通路、花生四烯酸代謝等多個通路作用，抑制炎癥因子和神經(jīng)遞質的產生、減輕血管炎癥、減少腦損傷和降低血腦屏障通透性，達到整體治療偏頭痛的目的。