狂犬病病毒CTN-1 株在人用狂犬病疫苗中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

石磊泰 綜述，李玉華 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

狂犬病病毒CTN-1 株由中國(guó)藥品生物制品檢定所（現(xiàn)中國(guó)食品藥品檢定研究院）分離并保存。CTN-1 株是1956 年從山東省淄博市1 名死于狂犬病的患者腦組織中提取的，當(dāng)時(shí)該病毒被命名為CTN-S1 株，經(jīng)小鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代56 代后變?yōu)楣潭ǘ荆幻麨镃TN-M 株，后續(xù)在KMB-17 細(xì)胞上連續(xù)傳代50 代適應(yīng)為CTN-1 株。CTN-1 株經(jīng)全面檢定后未發(fā)現(xiàn)被外源病毒污染，抗原性與固定毒一致［1-3］。

本文對(duì)狂犬病病毒CTN-1 株在狂犬病疫苗中應(yīng)用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 細(xì)胞傳代適應(yīng)性

1. 1 在Vero 細(xì)胞等傳代細(xì)胞上的適應(yīng)性 李宏玲等［4］發(fā)現(xiàn)，用Vero 細(xì)胞培養(yǎng)CTN 病毒時(shí)，CTN-42代病毒和CTN-103 代病毒的滴度在第8 代后顯著增加，在第17 代后保持高水平，其中CTN-42 株平均滴度達(dá)7.13 lgLD50／mL，CTN-103 株達(dá)6.6 lgLD50／mL，且兩株病毒增殖高峰均提前3 ～5 d，空斑形態(tài)大小也較適應(yīng)前清晰，直徑增大至1. 0 ～1. 5 mm。表明CTN 株在Vero 細(xì)胞適應(yīng)后可達(dá)到較高滴度，適用于疫苗生產(chǎn)。

董關(guān)木等［5］和王宏偉等［6］進(jìn)一步證實(shí)，CTN-1株用Vero 細(xì)胞培養(yǎng)可快速適應(yīng)，病毒滴度達(dá)7. 0 ～7. 5 lgLD50／ mL 以上，可多次收獲培養(yǎng)液；在5 ～20 代內(nèi)，病毒滴度均穩(wěn)定在7. 0 lgLD50／ mL 左右。后續(xù)董關(guān)木等［7］對(duì)CTN-1 株在Vero 細(xì)胞上的吸附及增殖特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，CTN-1 株對(duì)Vero細(xì)胞有較強(qiáng)的吸附作用，接觸后可大量吸附。MOI為0. 1 時(shí)，10 min 內(nèi)細(xì)胞可吸附99%以上的病毒；MOI 為1. 0 時(shí)，上清液中有大量病毒無(wú)法吸附至細(xì)胞上，60 min 后，超過(guò)98%的病毒可被吸附。CTN-1株在Vero 細(xì)胞中的復(fù)制周期小于16 h。此外，細(xì)胞內(nèi)有相當(dāng)高的傳染性病毒顆粒，其滴度同時(shí)高于細(xì)胞外，72 h 內(nèi)細(xì)胞內(nèi)外比例基本平衡。CTN-1 株的這一特性表明病毒培養(yǎng)至收獲的最佳周期為3 ～4 d，這樣當(dāng)細(xì)胞感染時(shí)，死亡病毒較少，很容易一次達(dá)到最大感染量。

郭金華等［8］觀察了狂犬病病毒CTN-1 株在Vero細(xì)胞中的生長(zhǎng)和感染特征。通過(guò)分離和混合的方法確定了Vero 細(xì)胞的生長(zhǎng)以及細(xì)胞內(nèi)外的病毒含量。結(jié)果表明，Vero 細(xì)胞的形態(tài)隨病毒接種時(shí)間的變化而變化，不同接種方法的病毒滴度無(wú)明顯差異。4 ～9 d 病毒滴度最高，第4 天細(xì)胞病毒感染率超過(guò)80%，第10 天后開(kāi)始下降，并在第15 天達(dá)到最低點(diǎn)。確定了最佳收獲時(shí)間為4 ～9 d，MOI 為0. 01 ～0. 10。

孫怡等［9］比較了3 種傳代細(xì)胞系（Vero、BHK-21 和MDCK 細(xì)胞）對(duì)狂犬病病毒CTN-1 株的敏感性。研究采用混種的方法，將CTN-1 株分別接種至上述3 種不同來(lái)源的連續(xù)傳代細(xì)胞系，在不同時(shí)間觀察3 種細(xì)胞的病變情況，同時(shí)應(yīng)用快速免疫熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescence focus inhibition test，RFFIT）和ELISA 法檢測(cè)病毒滴度和抗原含量，分析不同來(lái)源細(xì)胞對(duì)CTN-1 株的敏感性。結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞培養(yǎng)的CTN-1 株病毒滴度在第8 天達(dá)到高峰，為7. 80 lgFFD50／ mL，BHK-21 細(xì)胞在第6 天達(dá)到高峰，為7. 30 lgFFD50／ mL，而MDCK 細(xì)胞在第6 天僅為5. 55 lgFFD50／ mL。BHK-21 細(xì)胞培養(yǎng)的CTN-1株抗原含量值在各代次均高于Vero 和MDCK 細(xì)胞。表明Vero 和BHK-21 細(xì)胞對(duì)狂犬病病毒CTN-1 株的敏感性高于MDCK 細(xì)胞，且BHK-21 細(xì)胞產(chǎn)毒高峰較Vero 細(xì)胞提前。

孫燕等［10］初步建立了無(wú)血清培養(yǎng)Vero 細(xì)胞制備狂犬病病毒的方法，為大規(guī)模制備無(wú)血清狂犬病疫苗奠定了基礎(chǔ)。研究采用無(wú)血清培養(yǎng)基（VP-SFM）和含5%牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero 細(xì)胞，制備狂犬病病毒CTN-1V 株，比較無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同代次Vero 細(xì)胞及含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細(xì)胞制備的病毒的滴度和效價(jià)。向250 mL 搖瓶中加入2 g／L 微載體cytodex-1，加入Vero 細(xì)胞后37 ℃培養(yǎng)3 d，按MOI = 0. 02 感染狂犬病病毒CTN-1V株，檢測(cè)病毒收獲液的病毒滴度及效力，每日鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，計(jì)算比細(xì)胞生長(zhǎng)率。結(jié)果顯示，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞制備的病毒的滴度及效價(jià)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0. 05）；在無(wú)血清和含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞制備的病毒的效價(jià)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。無(wú)血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備的病毒的效果優(yōu)于含血清培養(yǎng)基（P ＜0.05）。用攪拌瓶微載體培養(yǎng)Vero 細(xì)胞制備狂犬病病毒，細(xì)胞黏附均勻，生長(zhǎng)良好。收獲病毒液的平均滴度為6. 50 lgFFU ／ mL，平均效力為6. 77 IU ／ mL。

1. 2 在雞胚細(xì)胞上的適應(yīng)性 GUO 等［11］、李慧等［12］、ZHU 等［13］在研究CTN-1 株適應(yīng)雞胚細(xì)胞方面取得了進(jìn)展，并研究了CTN-1 株在雞胚細(xì)胞馴化過(guò)程中的特性。利用RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增CTN-1 株19 個(gè)代次的G 蛋白基因，獲得cDNA 進(jìn)行序列測(cè)定，并采用免疫熒光法測(cè)定各代次毒株在細(xì)胞中的滴度。序列測(cè)定結(jié)果顯示，CTN-1 株在雞胚細(xì)胞馴化過(guò)程中G蛋白基因序列發(fā)生不同程度變異且逐步積累，從第30 代開(kāi)始，趨于穩(wěn)定。與CTN-1 株相比，雞胚細(xì)胞馴化株在G 蛋白的第147、333、389、421 和485 位氨基酸發(fā)生了突變。與此對(duì)應(yīng)，CTN-1 株雞胚細(xì)胞馴化株滴度逐漸趨于穩(wěn)定，第33 ～58 代滴度維持在7. 0 ～7. 5 lgFFU ／ mL。G 蛋白同源性分析結(jié)果表明，CTN-1 株雞胚細(xì)胞馴化株與我國(guó)近期不同區(qū)域分離得到的街毒株具有較高同源性，其G 蛋白氨基酸同源性為89. 3% ～99%。CTN-1 株在雞胚細(xì)胞馴化過(guò)程中G 蛋白基因發(fā)生穩(wěn)定變異，滴度在傳代后33 ～58 代達(dá)到較高水平，穩(wěn)定性較好。將CTN-1株在雞胚細(xì)胞的適應(yīng)株命名為CTNCEC25 株。

王春華等［14］證實(shí)CTNCEC25 株是高度減毒、不易返祖的弱毒株，其在雞胚細(xì)胞上可穩(wěn)定、快速增殖，病毒滴度高（＞7. 0 lgFFU ／ mL），是安全性較高的狂犬病疫苗候選毒株。研究狂犬病病毒CTNCEC25株的增殖能力、病毒感染力及致病力等表型特征，為將該毒株應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)提供了參考。將CTNCEC25株及其母株CTN-1 株分別接種Vero、原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEC 細(xì)胞）和小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞（N2a 細(xì)胞），觀察細(xì)胞病變及復(fù)制規(guī)律；以腦內(nèi)注射的方式接種動(dòng)物，觀察其對(duì)乳鼠、小鼠、豚鼠及家兔等動(dòng)物的致病力；同時(shí)還將CTNCEC25 株在CEC 細(xì)胞上連續(xù)傳20 代，在乳鼠腦內(nèi)傳3 代，觀察其增殖能力、病毒感染力及致病力。結(jié)果表明，與母株CTN-1 株相比，CTNCEC25 株在Vero 和N2a 細(xì)胞上的增殖無(wú)顯著差異，但在CEC 細(xì)胞上有明顯優(yōu)勢(shì)，72 h 滴度可達(dá)7. 5 ～7. 6 lgFFU ／ mL，而CTN-1 株滴度僅為5. 8 lgFFU ／ mL；此外CTNCEC25 株在N2a、Vero 及CEC 細(xì)胞上均可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。腦內(nèi)致病力結(jié)果顯示，CTNCEC25 株雖然對(duì)1 ～3 日齡乳鼠仍有較強(qiáng)腦內(nèi)致病性，但對(duì)成年小鼠腦內(nèi)致病力大大減弱，對(duì)豚鼠和家兔不致病。經(jīng)細(xì)胞和乳鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代，CTNCEC25 株在CEC 細(xì)胞上增殖穩(wěn)定，其減弱的毒力并未回升，無(wú)弱毒返祖現(xiàn)象。

郭采平等［15］對(duì)CTNCEC25 株在CEC 細(xì)胞上的培養(yǎng)工藝進(jìn)行了研究，以M199 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入人血白蛋白、胎牛血清及HEPES 緩沖液，并均加入碳酸氫鈉，配制培養(yǎng)基M1、M2 和M3。將馴化獲得的CTNCEC25 株按1 ∶5 000 的比例接種至CEC細(xì)胞懸液中，在不同培養(yǎng)條件下，初步確定培養(yǎng)基配方、溫度、MOI 和時(shí)間4 大工藝參數(shù)范圍，再以正交試驗(yàn)確定上述條件的最佳組合。單因素試驗(yàn)初步確定的工藝參數(shù)：采用M2 或M3，培養(yǎng)溫度33 ～36 ℃，MOI=0.01 ～0.001 FFU／細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間72 ～120 h，可獲得較高的病毒滴度（7. 0 lgFFU ／ mL 以上）。正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件：采用M3，培養(yǎng)溫度33 ℃，MOI = 0. 01 FFU ／ 細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間120 h，獲得的病毒滴度達(dá)7. 5 lgFFU ／ mL。優(yōu)化了CEC 細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病病毒的工藝，CTNCEC25 株的病毒滴度由6. 0 lgFFU ／ mL 左右提高至7. 0 lgFFU ／ mL 以上，為獲得理想疫苗抗原量積累了數(shù)據(jù)。

1. 3 在二倍體細(xì)胞上的適應(yīng)性 毛子安等［16］的研究顯示，將狂犬病病毒固定毒株CTN-1 連續(xù)在人二倍體細(xì)胞（KMB17）中傳代，并以終末稀釋法篩選出滴度較高的病毒，從而獲得適應(yīng)于人二倍體細(xì)胞（KMB17）并具有良好免疫原性和傳代穩(wěn)定性的狂犬病病毒株，培育出可在人二倍體細(xì)胞（KMB17）高效增殖的狂犬病疫苗毒種（CTN-DK 株）。用該毒種生產(chǎn)人二倍體細(xì)胞（KMB17）狂犬病疫苗可有效避免當(dāng)前國(guó)內(nèi)使用的疫苗中異種DNA 殘留引起的風(fēng)險(xiǎn)，將進(jìn)一步提高我國(guó)狂犬病疫苗的安全性及實(shí)用性，具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

何麗芳等［17］、MA 等［18］、徐道俊等［19］用狂犬病病毒固定毒CTN-1V 株經(jīng)昆明鼠腦內(nèi)傳代后的病毒接種人胚肺二倍體細(xì)胞Walvax-2，連續(xù)傳代后檢測(cè)各代病毒的滴度及免疫原性。結(jié)果顯示，CTN-1V株能較好地適應(yīng)Walvax-2 細(xì)胞，通過(guò)連續(xù)帶毒傳代至第7 代，病毒滴度可達(dá)6. 78 lgLD50／ mL，第10 ～15 代內(nèi)滴度可以維持在7.0 lgLD50／mL 以上，第15 ～30 代滴度穩(wěn)定在7. 0 lgLD50／ mL 左右。以15 代適應(yīng)毒株CTN-1V-HDC P15 制備的疫苗原液，各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中國(guó)藥典》三部（2010 版）通用要求，疫苗效力在6. 0 IU ／ 劑以上。用0. 05 MOI 接種病毒，采用的人二倍體細(xì)胞量≥2 × 108個(gè)，37 ℃懸浮混合吸附30 min，用DMEM + 0. 3%人血白蛋白作為病毒維持液（pH 7. 8 ～8. 0），換液3 d 后開(kāi)始收獲病毒液，之后再進(jìn)行5 ～7 d 病毒液的收獲，經(jīng)動(dòng)物法和細(xì)胞法檢測(cè)收獲液病毒滴度。結(jié)果顯示，3 次收獲液病毒滴度均＞7. 0 lgLD50／ mL。建立了穩(wěn)定的狂犬病病毒株CTN-1V 在Walvax-2 細(xì)胞上的病毒收獲液制備工藝。Walvax-2 細(xì)胞傳代適應(yīng)狂犬病病毒固定株CTN-1V-HDC，可用于人用狂犬病疫苗的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)。

崔棟等［20］一項(xiàng)涉及微生物及生物制藥領(lǐng)域的研究中，將狂犬病病毒株CTN-1V 在二倍體細(xì)胞MRC-5 的適應(yīng)株命名為SNK-CTN 株。該病毒株通過(guò)以下方法制備：取MRC-5 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)3 d 成單層細(xì)胞后，用0. 25%胰酶消化分散成均勻細(xì)胞，按0. 01 ～1. 0 MOI 接種狂犬病病毒CTN-1V5 株懸液，37 ℃培養(yǎng)2 ～3 d；更換為含2% ～4%牛血清的維持液，33 ～35 ℃培養(yǎng)3 ～5 d；收獲病毒液，-70 ℃凍存，制備成病毒懸液；用上述方法連續(xù)在MRC-5 細(xì)胞上傳30 ～32 代。

1. 4 在原代地鼠腎細(xì)胞上的適應(yīng)性 早在2002 年，張玉慧等［21］曾經(jīng)嘗試將CTN-1 株在原代地鼠腎細(xì)胞（PHKC）上傳代適應(yīng)，經(jīng)10 多代適應(yīng)性傳代后，病毒滴度達(dá)7. 0 lgLD50／ mL，并應(yīng)用適應(yīng)株（CTNLS-HK）細(xì)胞毒種制備了3 批疫苗，效力為6. 11 ～6. 55 IU ／ mL。

2 基因特性

2. 1 糖蛋白（G）和核蛋白（N）的基因特性 狂犬病病毒糖蛋白（G）是決定抗原性、組織嗜性及毒力的最重要部分［22］。董關(guān)木等［5］完成CTN-1 株在Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性傳代后（即CTN-1V），吳小紅等［23］在2003 年隨即開(kāi)展了CTN-1 株糖蛋白測(cè)序工作，利用RT-PCR 反應(yīng)從感染CTN-1V 的Vero 細(xì)胞中獲得糖蛋白全長(zhǎng)cDNA 片段，并克隆至PCR2. 1 載體后進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果顯示，CTN-1V 株糖蛋白cDNA 序列長(zhǎng)度為1 575 個(gè)核苷酸，編碼524 個(gè)氨基酸。與國(guó)內(nèi)外已測(cè)定的狂犬病病毒糖蛋白序列，如aG、CGX89-1、SBD 07、CVS、HEP-Flury、N. HL、ERA、PV、RC-HL、SAD B19、Nisss higah aam 和Vnukovo-32，進(jìn)行同源性比較，核苷酸同源性為80. 8% ～92. 4%，氨基酸同源性為82. 9% ～93. 3%。其中，CTN-1V 糖蛋白與國(guó)內(nèi)分離自廣西的街毒株CGX89-1、分離自上海的街毒株SBD07 的氨基酸同源性高達(dá)85. 5% ～93. 3%，提示CTN-1V 株與國(guó)內(nèi)流行株的基因結(jié)構(gòu)一致，可預(yù)測(cè)CTN-1 株狂犬病疫苗對(duì)國(guó)內(nèi)街毒株具有較好的保護(hù)作用。

明平剛等［24］將CTN-1-V5 株（Vero 細(xì)胞適應(yīng)株第5 代）在鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代至35 代，選取CTN-1-V7、CTN-1-V28 和CTN-1-V35 共3 個(gè)代次的毒株進(jìn)行糖蛋白序列測(cè)定。結(jié)果表明，3 代CTN-1-V 株與我國(guó)目前使用的疫苗株CTN-1-V5 的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列同源性均較高，親緣關(guān)系均較近，表明CTN-1-V 株盡管傳代次數(shù)不同、傳代方式不同，但仍然保持相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性；在進(jìn)化樹(shù)上，3 個(gè)代次CTN-1-V 非常接近，肯定了其作為狂犬病病毒疫苗株的有效性。

而孟勝利等［25］在明平剛等［24］研究的基礎(chǔ)上挑選CTN-1-7、CTN-1-26、CTN-1-27、C TN-1-28、CTN-1-29、CTN-1-30、CTN-1-33 和CTN-1-35 共8 個(gè)代次的毒株進(jìn)行核蛋白和糖蛋白的序列測(cè)定。結(jié)果顯示，CTN-1 株8 個(gè)代次之間的核苷酸序列幾乎完全相同。CTN-1 株在傳代過(guò)程中N 和G 基因變異小，與中國(guó)流行的代表性街毒株的同源性高于其他疫苗株。與我國(guó)分離的街毒株相比，核苷酸的同源性分別為84. 2% ～95 0%和80. 4% ～94. 3%，氨基酸同源性分別為92. 1% ～99. 6%和88. 7% ～98. 5%。

2. 2 全基因序列的基因特性 2010 年，吳小紅等［23］的觀點(diǎn)得到了另一項(xiàng)研究的證實(shí)。在該項(xiàng)研究中，石磊泰等［26］首次對(duì)我國(guó)狂犬病疫苗生產(chǎn)株CTN-1進(jìn)行了全序列測(cè)定及分析。利用RT-PCR 方法分段擴(kuò)增CTN-1 株全基因組序列，隨后進(jìn)行測(cè)序，用Meg-Align 軟件比較CTN-1 株全序列與國(guó)內(nèi)外狂犬病病毒疫苗株、街毒株全序列的同源性，再以糖蛋白G 基因?yàn)槟０?，用ClustalX 和MEGA4 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，CTN-1 株全序列長(zhǎng)度為11 925 nt（GenBank 登錄號(hào)：FJ959397），為基因Ⅰ型，與國(guó)內(nèi)外狂犬病疫苗株、街毒株全序列之間的同源性為81. 5% ～93. 4%，與美國(guó)蝙蝠分離株SHBRV18 的同源性最低，僅為81. 5%，與中國(guó)新分離的野毒株HN10 的同源性最高，為93. 4%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，CTN-1 株與國(guó)內(nèi)大多數(shù)街毒株聚類于同一組內(nèi)，而我國(guó)另一疫苗株aG 株與Flury、PM、PV、ERA、RC2HL 等疫苗株和少數(shù)中國(guó)街毒株聚類于另一組內(nèi)。G 基因氨基酸對(duì)比顯示，CTN-1 株與國(guó)內(nèi)大多數(shù)街毒株的同源性高于其他疫苗株。表明CTN-1 株較其他疫苗株更適合用于預(yù)防我國(guó)的狂犬病，這一結(jié)論為CTN-1株在我國(guó)實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)奠定了理論基礎(chǔ)。需要注意的是，該結(jié)論在2020 年被印度的T. Nagarajan 和美國(guó)的C. E. Rupprecht 曲解和錯(cuò)誤引用，因?yàn)樗麄兎裾J(rèn)同源性分析用于說(shuō)明毒株親緣關(guān)系的作用［27］。

2018 年的另一篇報(bào)道證實(shí)了石磊泰等［26］的研究結(jié)論。盧學(xué)新等［28］的這篇報(bào)道涉及了CTN-1 株的研究，他們通過(guò)RT-PCR 法獲取CTN-1 株主種子批的全基因組序列，與國(guó)內(nèi)分離的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)狂犬病病毒主要抗原進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，CTN-1 株與我國(guó)街毒株的親緣關(guān)系更近，符合作為疫苗候選株的要求。

3 免疫保護(hù)

3. 1 暴露前免疫保護(hù) CTN-1 株用于人體的免疫原性的報(bào)道較早的文獻(xiàn)可能是于偉等［29］2001 年的一項(xiàng)研究，他們以Vero 細(xì)胞為基質(zhì)，以CTN-1V10 為生產(chǎn)毒株，以＜150 代Vero 細(xì)胞為培養(yǎng)基質(zhì)，采用轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，按不同時(shí)間收獲病毒液，經(jīng)澄清、濃縮、純化、滅活制成精制Vero 細(xì)胞狂犬病疫苗。從以此工藝制備的疫苗中選取1 批為免疫學(xué)效果觀察的受試疫苗。按暴露后免疫程序接種63 人，其中受試疫苗接種33 人，法國(guó)維爾博狂犬病疫苗接種30 人，觀察不良反應(yīng)并檢測(cè)中和抗體。結(jié)果顯示，新研制的精制Vero 細(xì)胞狂犬病疫苗各項(xiàng)指標(biāo)完全符合WHO的相關(guān)質(zhì)量要求。兩種疫苗全程免疫后中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%，中和抗體受試組為11. 94 IU ／ mL，維爾博疫苗對(duì)照組為11. 69 IU ／ mL。表明CTN-1精制Vero 細(xì)胞人用狂犬病疫苗不但制造工藝合理，且副反應(yīng)輕微，免疫原性良好。

錢浩等［30］的一項(xiàng)研究也觀察到了類似的現(xiàn)象，他們選擇20 例健康受試者接種應(yīng)用CTN-1V 株毒種制備的狂犬病疫苗，觀察接種者的不良反應(yīng)并檢測(cè)中和抗體。結(jié)果顯示，接種者不良反應(yīng)率為35%（7／20），中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為100%，免疫后14 d 中和抗體水平平均為13.08 IU／ mL（5.83 ～22.16 IU／mL）。表明CTN-1V 株毒種不良反應(yīng)輕微且免疫原性良好，可在短時(shí)間產(chǎn)生較高水平的中和抗體。

陳偉等［31］為了觀察人用凍干狂犬病疫苗（Vero細(xì)胞／ CTN 疫苗株）的安全性、免疫原性和抗體持久性，進(jìn)行了大規(guī)模人群的研究。將450 名健康志愿者隨機(jī)分為2 組，300 人（試驗(yàn)組）接種人用凍干狂犬病疫苗，150 人（對(duì)照組）接種進(jìn)口凍干狂犬病純化疫苗。按照0、3、7、14、28 d 免疫程序，觀察每針次接種后局部和全身反應(yīng)，采用RFFIT 試驗(yàn)檢測(cè)0、3、7、14、28 d 血清中和抗體水平（GMT）。初次免疫后365 d，采集試驗(yàn)組血液樣本212 份，對(duì)照組血液樣本97 份；初次免疫后730 d，采集試驗(yàn)組血液樣本176 份，對(duì)照組血液樣本80 份。結(jié)果顯示，接種者均未出現(xiàn)嚴(yán)重的局部或全身反應(yīng)。初次免疫后3、7、14、28、365 和730 d，試驗(yàn)組抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為2.35%、80. 78%、100. 00%、100. 00%、98. 58%和73. 30%，GMT 分別為0.12、1.01、9.83、12.61、3.68 和2.81IU／mL；對(duì)照組抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為4.00%、87.20%、100.00%、100. 00%、97. 94%和76. 25%，GMT 分別為0. 13、1. 18、10. 24、11. 61、4. 18 和1. 92 IU ／ ml。試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0. 05）。表明人用凍干狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞／ CTN 疫苗株）具有良好的安全性、免疫原性和抗體持久性。

2017 年黃莉榮等［32］針對(duì)國(guó)內(nèi)一家即將上市銷售的、以CTN-1 株生產(chǎn)的凍干人用狂犬病疫苗（Vero細(xì)胞）進(jìn)行了安全性和免疫原性考察。在廣西岑溪市和蒼梧縣共選擇1 200 名10 ～60 歲健康受試者。采用隨機(jī)、盲法、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將1 200 名受試者按1 ∶1 的比例隨機(jī)配對(duì)，接種試驗(yàn)疫苗和對(duì)照疫苗（市場(chǎng)上同類產(chǎn)品）。按第0、3、7、14 和28 天的免疫程序，在初次接種疫苗后42 d 的隨訪期間觀察到全身和局部不良反應(yīng)。初次接種后第14 和42 天采集血樣，采用RFFIT 試驗(yàn)檢測(cè)狂犬病病毒中和抗體，計(jì)算抗體幾何平均濃度（GMC）。結(jié)果顯示，1 199名受試者完成了安全性觀察。試驗(yàn)疫苗組（600 例）和對(duì)照疫苗組（599 例）全身反應(yīng)發(fā)生率分別為12.33%和18. 03%（P ＜0. 05），常見(jiàn)癥狀為發(fā)熱（發(fā)生率分別為8. 00%和13. 19%），局部反應(yīng)發(fā)生率分別為5. 33%和10. 52%（P ＜0. 05）。同時(shí)觀察了1 147 名受試者的免疫原性。初次免疫后，試驗(yàn)疫苗組（571例）和對(duì)照疫苗組（576 例）抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率在第14 天分別為100. 00%和99. 83%，第42 天均為100. 00%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0. 05）；第14 天抗體GMC分別為8. 94 和7. 96 IU ／ mL，第42 天分別為17. 26和15. 04 IU ／ mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0. 05）。表明凍干人用狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞／ CTN-1 株）具有良好的安全性及免疫原性。目前該疫苗已于2017年上市，2019 年的批簽發(fā)量為202. 4 萬(wàn)支［33］。

2018 年黃騰等［34］進(jìn)行了一項(xiàng)評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)CTN-1V 株人用狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞）在10 ～60 歲健康受試者中的安全性及免疫原性的研究。他們使用了同類產(chǎn)品的隨機(jī)、盲目、并行控制設(shè)計(jì)。將廣西永?？h的900 名受試者隨機(jī)配對(duì)，以2 ∶1 的比例接種試驗(yàn)疫苗和對(duì)照疫苗，觀察安全性。所有受試者均在初次免疫前以及免疫后14 和45 d 采集靜脈血，經(jīng)RFFIT 試驗(yàn)檢測(cè)血清中抗狂犬病病毒的中和抗體效價(jià)，計(jì)算GMC。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組不良反應(yīng)發(fā)生率分別為32. 33%和38. 67%（P ＜0. 05）。接種部位的局部反應(yīng)主要為疼痛、發(fā)紅、腫脹和瘙癢，而全身反應(yīng)主要為發(fā)燒、頭痛和疲勞，且大多數(shù)是輕度（1 級(jí)）。免疫后14 和45 d，試驗(yàn)組狂犬病病毒中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100. 00%，GMC 分別為9. 96 和28. 83 IU ／ mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0. 05）。表明國(guó)產(chǎn)CTN-1V 株人用狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞）具有良好的安全性和免疫原性。目前該疫苗也于2017 年上市，2019 年的批簽發(fā)量為128. 3 萬(wàn)支［32］。

3. 2 暴露后免疫保護(hù) 程滿榮等［35］在2008 年進(jìn)行了關(guān)于CTN-1 株疫苗暴露后免疫的研究。他們用CTN-1 株疫苗免疫小鼠，用3 株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J 和標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS 經(jīng)腦內(nèi)和肌肉攻擊，以未免疫小鼠的腦內(nèi)和肌肉攻擊為對(duì)照，觀察CTN-1 株疫苗的保護(hù)效果。結(jié)果顯示，原倍和5 倍稀釋的疫苗免疫的小鼠經(jīng)3 株街毒肌肉攻擊后，均獲得100%的保護(hù)，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0. 05）；原倍疫苗免疫的小鼠經(jīng)3 株街毒腦內(nèi)攻擊后，均獲得100%的保護(hù)，5 倍稀釋的疫苗免疫的小鼠對(duì)3 株街毒CQ92、HN06、J 的保護(hù)率分別為85%、75%和77. 8%，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出CTN-1株疫苗總體上能有效預(yù)防我國(guó)目前狂犬病的流行。

4 結(jié) 語(yǔ)

1994年10月—2001年10月中國(guó)藥品生物制品檢定所（現(xiàn)中國(guó)食品藥品檢定研究院）董關(guān)木等［36］利用衛(wèi)生部科技貸款和自籌資金，將我國(guó)自行分離、減毒的狂犬病病毒CTN-1 株適應(yīng)于Vero 細(xì)胞。該病毒在Vero 細(xì)胞中增殖迅速，病毒滴度可達(dá)8.0 lgLD50／mL以上，產(chǎn)量高且免疫原性好，該病毒已被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)為人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒種，并于2005 年被WHO 正式出版的文件（WHO TRS 941）確認(rèn)為人用疫苗的毒種［37］。

狂犬病病毒CTN-1 株在我國(guó)分離、馴化、減毒、建立和應(yīng)用，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，并已完全適應(yīng)Vero細(xì)胞，具有效價(jià)高、免疫原性好、濃縮倍數(shù)少、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)人群有較好的保護(hù)作用。經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)、免疫化學(xué)、分子生物學(xué)、基因測(cè)序和動(dòng)物流行病學(xué)等綜合驗(yàn)證，該毒株符合國(guó)家［38］和WHO［39］相關(guān)人類疫苗生產(chǎn)的要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

CTN-1 株完全適應(yīng)于Vero 細(xì)胞后，2001 獲得新藥證書，目前已投入規(guī)?；a(chǎn)，先后有7 家公司實(shí)施產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。由于CTN-1 株與我國(guó)街毒株親緣關(guān)系更近，因此更適用于制備我國(guó)預(yù)防狂犬病的疫苗。

近年來(lái)，有不少研究單位及生產(chǎn)機(jī)構(gòu)用CTN-1 株在雞胚細(xì)胞和二倍體細(xì)胞上進(jìn)行適應(yīng)性傳代，也已取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展［11-20］；還有機(jī)構(gòu)發(fā)明了以CTN-1 株為模板構(gòu)建的mRNA 人用狂犬病疫苗［40］。期待不同細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的、新型的CTN-1 株人用狂犬病疫苗早日上市，為實(shí)現(xiàn)早日消除狂犬病的目標(biāo)而努力。