女性生殖道微生物群與不孕癥的相關(guān)性研究進展

王曉麗，楊曉葵

人體體表、體腔內(nèi)存在的大量非致病微生物群與人類宿主共同構(gòu)成了“共生總體”，協(xié)同進化，互利共生，這些微生物參與人體多種生物學(xué)過程，在人類的生存和進化中發(fā)揮重大作用，如對抗病原體、促進免疫系統(tǒng)成熟、參與代謝及合成維生素、調(diào)節(jié)生殖健康、影響子代健康等[1]。女性生殖道是一個開放系統(tǒng)，除陰道附著大量常住菌外，上生殖道也定植著多樣而低豐度的菌群[2]。這些常住共生菌與生殖道黏膜一起構(gòu)成了生殖道的第一道免疫防線[3]。微生物群失調(diào)可導(dǎo)致免疫屏障破壞，局部生理功能改變，引發(fā)胚胎著床失敗、流產(chǎn)及各種孕期并發(fā)癥，進而影響生殖結(jié)局[4]。本文回顧了近期國內(nèi)外關(guān)于女性生殖道各部位微生物群的組成和影響因素以及生殖道微生物群失調(diào)與不孕癥相關(guān)性的研究進展，尤其關(guān)注生殖道菌群對輔助生殖技術(shù)的影響，并簡述人類宿主免疫系統(tǒng)與微生物的相互作用及女性生殖道微生物群未來的研究方向。

1 微生物群概述

微生物群也稱為微生物區(qū)系，指包括細菌、病毒、真菌等共生總體中所有微生物的集合，參與機體的免疫、生物屏障等多種生理功能[1]。

隨著現(xiàn)代技術(shù)的飛速發(fā)展，人類對微生物群的了解不斷深入，傳統(tǒng)的微生物檢測方法(包括光學(xué)顯微鏡及培養(yǎng)法)已不能滿足對微生物群的研究?；蚪M測序技術(shù)的出現(xiàn)和持續(xù)發(fā)展為全面了解和研究微生物群提供了有力的支撐，目前已經(jīng)建立的檢測平臺包括16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)測序、全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)、IS-pro(intergenic spaces-pro)技術(shù)及實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)等。其中，16S rRNA測序技術(shù)為二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)，以進化樹的形式分析微生物群落結(jié)構(gòu)[4]，目前應(yīng)用最為廣泛。

2 女性生殖道微生物群及影響因素

2.1 陰道微生物群

陰道常住菌有乳桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、棒狀桿菌、鏈球菌等，其中乳桿菌為優(yōu)勢菌，通常占90%以上[5]，載菌量達107～109/g分泌物[2]。

乳桿菌通過多種機制保護陰道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。首先，產(chǎn)生乳酸，形成陰道內(nèi)酸性環(huán)境，產(chǎn)生過氧化氫、細菌素、表面活性物質(zhì)等，抑制其他細菌生長；其次，乳桿菌結(jié)合到陰道上皮表面，以機械屏障方式阻止其他細菌與上皮細胞結(jié)合；再者，乳桿菌及其產(chǎn)物還可激活機體的先天免疫系統(tǒng)成分對抗病原體[6-7]。

多種因素可以影響陰道菌群變化。其中，卵巢激素尤其是雌激素，對陰道菌群影響較大。育齡期女性以乳桿菌為主[2，5]，菌群的種類在月經(jīng)期呈多樣性，在排卵期及黃體中期最穩(wěn)定[7]；絕經(jīng)后因雌激素降低導(dǎo)致乳桿菌定植顯著減少。此外，陰道菌群受到口服避孕藥、宮內(nèi)節(jié)育器、性伴侶數(shù)量、種族等多種因素影響[8]。

2.2 宮腔微生物群

傳統(tǒng)觀念認為宮腔無菌，新近研究證實宮腔內(nèi)可能存在定植菌，且非病理性定植[9]。迄今為止，大多數(shù)研究報告宮腔菌群以乳桿菌為主[4, 10]，另有豐富的鏈球菌科及雙歧桿菌科。在宮腔微生物群組成方面，不同研究結(jié)果并不一致。Chen C等[2]聯(lián)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法及基因組測序技術(shù)檢測到宮腔載菌量為陰道的萬分之一，乳桿菌并非主要菌群，假單胞菌屬、不動桿菌屬等占據(jù)了較大構(gòu)成比例，宮腔菌群種類呈高多樣性和低生物量，輕度弱堿性。2018年，該團隊采用WGS技術(shù)在宮腔內(nèi)又發(fā)現(xiàn)了真核細胞、病毒、古細菌及噬菌體的存在[11]。關(guān)于宮腔微生物群研究的差異可能與機體處于不同的生理或病理狀態(tài)有關(guān)。

宮腔微生物群與女性激素變化有關(guān)，在黃體中期較為穩(wěn)定[10]，其組成在分泌期和增殖期有明顯差異[2]，增殖期細菌繁殖多于分泌期，其隨時間或月經(jīng)周期改變的規(guī)律尚不明確。此外，宮腔菌群還受到陰道、腹腔菌群及妊娠的影響[12-13]。

2.3 輸卵管微生物群

輸卵管微生物群以假單胞菌屬等為主要菌群，乳桿菌占比僅為1.6%[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌未見于所有輸卵管標本中，輸卵管間質(zhì)部、壺腹部菌群存在明顯差異，雙側(cè)輸卵管的菌群也不盡相同，這些可能與血管系統(tǒng)、盆腔解剖及腹膜液體靜壓有關(guān)[14]。

2.4 卵巢微生物群

在卵泡期及排卵期，由于自發(fā)性子宮收縮，陰道后穹隆的細菌可穿過宮頸及子宮，上達輸卵管，甚至優(yōu)勢卵泡內(nèi)[12]。有研究者在子宮肌瘤、子宮腺肌病及子宮內(nèi)膜癌等患者的卵巢中發(fā)現(xiàn)了包括乳桿菌、棒狀桿菌、布勞特氏菌等的微生物群，個體間差異較大，考慮與疾病狀態(tài)有關(guān)[15]。目前尚無關(guān)于正常人卵巢或卵泡液微生物群組成及影響因素的研究報道。

3 微生物群異常與不孕

微生物群攜帶的微生物基因組同宿主基因組一樣，可以穩(wěn)定地從上一代傳遞至下一代，從而延續(xù)物種和共生總體的特性[16]。人體相關(guān)部位的微生物群之間存在著密切聯(lián)系。女性生殖道微生物群在生殖的各個階段均發(fā)揮重要作用，包括配子形成及運輸、受精、妊娠的建立和維持，甚至是新生兒出生前在母體宮腔內(nèi)菌群定植及在經(jīng)陰道分娩過程中母體陰道菌群在新生兒腸道內(nèi)定植[9]。當菌群失調(diào)時，通過炎癥反應(yīng)、免疫等機制導(dǎo)致不孕。

3.1 陰道微生物群失調(diào)

陰道菌群失調(diào)與不孕關(guān)系密切。細菌性陰道病(bacterial vaginosis, BV)的菌群特點是陰道菌群由正常的以乳桿菌為主變?yōu)楦鞣N細菌混雜，是最常見的陰道菌群失調(diào)。一項薈萃分析顯示，不孕女性中BV發(fā)生率高達16.4%，其中輸卵管性不孕者BV的發(fā)生率顯著高于因其他原因不孕者[17]，可能與BV相關(guān)細菌上行進入上生殖道引起輸卵管的亞臨床感染及繼發(fā)炎性損傷，繼而引起配子運輸障礙有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，不孕女性中以多囊卵巢綜合征患者及不明原因不孕患者BV發(fā)生率相對較高，分別為60.1%和37.4%，合并多囊卵巢綜合征的不孕女性BV的發(fā)生可能與激素異常(尤其是游離雄激素增高)導(dǎo)致陰道菌群調(diào)控失衡有關(guān)，其妊娠率在BV治療后明顯增加，這表明在多囊卵巢綜合征不排卵/稀發(fā)排卵導(dǎo)致不孕的基礎(chǔ)上，BV可能進一步通過影響胚胎著床而導(dǎo)致不孕率增加[18]。在輔助生殖技術(shù)中，陰道菌群失調(diào)還與不良生殖結(jié)局有關(guān)，不同基因檢測技術(shù)如16S rRNA測序[19]、IS-pro技術(shù)[20]均證實陰道微生物群以細菌種類少、乳桿菌屬為主要菌群的女性更容易在體外授精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)中成功妊娠。

3.2宮腔微生物群失調(diào)

宮腔菌群失調(diào)可引發(fā)持續(xù)性炎癥過程如慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis, CE)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能被破壞，影響胚胎著床。不孕人群中CE發(fā)生率可高達56.8%，CE主要通過引起雌孕激素受體表達異常使子宮內(nèi)膜蛻膜化受損、改變宮腔內(nèi)環(huán)境細胞因子、使子宮內(nèi)膜異常蠕動等機制，降低子宮內(nèi)膜容受性，干擾胚胎著床[21]。Liu Y等[22]應(yīng)用16S rRNA技術(shù)研究不孕女性宮腔液體中微生物群，發(fā)現(xiàn)CE組的乳桿菌豐度顯著低于無CE組。應(yīng)用抗生素治療CE后，可改善自然受孕率及反復(fù)種植失敗(recurrent implantation failure, RIF)胚胎著床率[21]。另一項評估抗生素對RIF患者CE療效的薈萃分析表明，與持續(xù)CE組相比，經(jīng)組織學(xué)確認已治愈CE組胚胎著床率及臨床妊娠率明顯增高[23]。

宮腔菌群失調(diào)還可通過降低子宮內(nèi)膜對性激素反應(yīng)性、糖蛋白分泌受損及胞飲突發(fā)育遲緩等機制影響胚胎著床[24]。對部分新鮮周期RIF的不孕女性采取冷凍胚胎移植可顯著提高妊娠率[25]，說明這組人群的宮腔微生物可能對卵巢刺激造成的超生理水平的性激素很敏感，進而影響了胚胎著床。此外，宮腔菌群失調(diào)可能會激活胚胎發(fā)育過程中抗血管生成的信號通路，改變滋養(yǎng)層和內(nèi)皮細胞功能，導(dǎo)致流產(chǎn)或產(chǎn)科并發(fā)癥如子癇前期的發(fā)生[26]。

宮腔菌群失調(diào)還可能通過炎癥反應(yīng)使子宮異常收縮和經(jīng)血逆流種植導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥而引起不孕和/或不良妊娠結(jié)局。“在位內(nèi)膜決定論”指明了該疾病的本質(zhì)在于宮腔在位內(nèi)膜，患有子宮內(nèi)膜異位癥的低生育力女性的宮腔菌群確實存在明顯異常，以功能為鞭毛組裝及芳香氨基酸合成的細菌種類為主[2]，在子宮內(nèi)膜異位癥患者的宮腔及卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫液中可以檢測到顯著增高的鏈球菌科、葡萄球菌科及腸桿菌科等[27]，進一步證實了生殖道微生物參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病。

宮腔菌群對胚胎著床的意義大于陰道菌群。對比RIF及首次行IVF-ET患者的生殖道菌群，兩者陰道菌群無差異；但兩者宮腔菌群有明顯差異，在RIF組宮腔中檢測到獨有的克伯氏菌[28]。宮腔菌群對自然妊娠預(yù)后也有提示意義，比較同一女性分別以孕8周自然流產(chǎn)(整倍體)和足月分娩為結(jié)局的前后兩次妊娠的宮腔菌群結(jié)果，發(fā)現(xiàn)前次妊娠宮腔菌群以非乳桿菌為主；后次則以乳桿菌為主(乳桿菌占91%)，且主要為惰性乳桿菌。這進一步證實宮腔菌群的優(yōu)勢菌群及菌種類別可對妊娠結(jié)局產(chǎn)生重要影響[29]。

3.3 輸卵管微生物群失調(diào)

輸卵管性不孕主要病因是性傳播疾病所引起的輸卵管炎癥，最常見的病原體為沙眼衣原體、淋病奈瑟菌等，其血漿中相應(yīng)抗體明顯升高[30]。輸卵管積液的不孕女性在切除輸卵管后，其助孕結(jié)局明顯改善，除了與去掉輸卵管積液的胚胎毒性、機械沖刷、子宮內(nèi)膜容受性受損等不良影響因素外，也可能與去除了輸卵管的內(nèi)源性致病微生物有關(guān)。由于取材受限等原因，尚無不孕女性輸卵管微生物群組成的相關(guān)研究。

3.4 卵巢微生物群失調(diào)

卵巢微生物群的組成與不同疾病狀態(tài)有關(guān)，可能在卵泡發(fā)育、多囊卵巢綜合征、卵巢早衰等與不孕相關(guān)的疾病中發(fā)揮作用，還需進一步研究[15]。而卵泡液中定植的微生物群與輔助生殖技術(shù)密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)卵泡液內(nèi)微生物群不同，其內(nèi)固有的定植菌群會導(dǎo)致不良生殖結(jié)局，明顯降低IVF成功率，而卵泡穿刺液中的乳桿菌有利于胚胎的成熟及移植[31]。

4 研究現(xiàn)狀與展望

在人類宿主與共生微生物進化過程中，正常微生物群被視為先天免疫系統(tǒng)的一部分，與黏膜屏障一起保護機體，同時又在上皮細胞、粘液、免疫球蛋白A、抗菌肽以及免疫細胞的聯(lián)合作用下與機體隔離[3, 16]。機體免疫細胞通過模式識別受體感知微生物的存在，建立宿主-微生物相互作用機制。

共生微生物群以生物屏障的模式，通過與病原體競爭營養(yǎng)和黏膜空間而發(fā)揮控制性防御作用，并維持微生物群內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當正常微生物群落的構(gòu)成比例變化或外源性病原體侵入，即生殖道菌群紊亂時，活菌、死菌及死菌碎片或細菌產(chǎn)物均可能通過誘發(fā)不同的免疫應(yīng)答而改變子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)，進而影響胚胎著床、發(fā)育[32]。子宮內(nèi)膜免疫系統(tǒng)非常獨特，既要適應(yīng)子宮內(nèi)膜周期性脫落、生長變化，又可耐受同種半異體移植的胚胎(即使是贈卵的胚胎)，說明微生物群、免疫系統(tǒng)及胚胎之間存在著微妙的交互作用。微生物紊亂與免疫系統(tǒng)異常可能互為因果關(guān)系，導(dǎo)致不孕。

不同于陰道的微生物群，上生殖道定植著特有的微生物群，且微生物種類多而生物量低，與生育力、女性激素水平、免疫等密切相關(guān)，尤其是乳桿菌的種類和占比，對生殖結(jié)局起到?jīng)Q定性作用。雖然因檢測技術(shù)、個體差異以及分別取不同組織做微生物檢測不能代表全部菌群[33-34]等因素的限制，尚不能得出“女性生殖道核心微生物群”的定論，但生殖道微生物學(xué)研究為人類生殖醫(yī)學(xué)的病理生理學(xué)基礎(chǔ)提供了新思路。

女性生殖道常住微生物群處于時間與空間動態(tài)變化的微妙平衡中。評估生殖道微生物群為人類生殖、妊娠及新的生命體開創(chuàng)了新視角，對改善女性生殖健康具有重要意義。隨著研究樣本量的擴大，取材技術(shù)的改進，結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫組學(xué)及代謝組學(xué)新技術(shù)新理論，人類將描繪出健康生殖道微生物群落結(jié)構(gòu)和層級，闡釋生殖道微生物的重要功能及微生物與宿主之間微妙關(guān)系，及時識別菌群失調(diào)，調(diào)整和優(yōu)化受孕時機，甚至靶向微生物干預(yù)，進一步改善人類健康和生育力。