卵巢癌腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的研究進展

王麗娟，梁曉磊，楊永秀

1 背景

卵巢癌是威脅女性健康的高度惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)2018年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年全球約有29.5萬新發(fā)病例，其中約18萬死亡。卵巢腫瘤中以上皮性腫瘤最常見，約占50%～70%。年齡、家族史、排卵周期及突變基因(如乳腺癌1/2號基因)等是其重要危險因素。卵巢癌早期往往無明顯癥狀，加之初發(fā)癥狀常常缺乏特異性，與消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)癥狀難以鑒別，因此常規(guī)診療程序如婦科檢查、血清CA125和經(jīng)陰道超聲檢查通常不能發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌[1]，超過一半的患者確診時已是晚期并已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]，5年生存率僅有20%～25%[3-4]，而對于能早期診斷的患者，5年生存率可達(dá)90%[5]?，F(xiàn)階段卵巢癌標(biāo)準(zhǔn)治療手段是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)加鉑類等化療藥的綜合治療，盡管完全緩解率高達(dá)60%～80%，但仍有近50%的患者后期會出現(xiàn)化療耐藥或復(fù)發(fā)[6]。卵巢癌的轉(zhuǎn)移與化療耐藥是當(dāng)前卵巢癌治療面臨的重要困難。因此，明確卵巢癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥的特有機制，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的有效靶點是當(dāng)前卵巢癌研究所必須解決的。

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(intratumoral heterogeneity，ITH)是指腫瘤中含有表型各不相同的細(xì)胞亞克隆，從而在細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力及治療反應(yīng)等方面表現(xiàn)不同[7]。癌癥在癌細(xì)胞及其微環(huán)境的相互作用下動態(tài)發(fā)展，異質(zhì)性也在這個過程中逐步形成。有人認(rèn)為遺傳不穩(wěn)定性是腫瘤發(fā)展中產(chǎn)生異質(zhì)性的基礎(chǔ)，早在1958年，進化生物學(xué)家Huxley就已經(jīng)提出了癌癥中“遺傳不均一性”的觀點[8]。由外源性刺激(如煙霧或紫外線等)和內(nèi)源性染色體畸變推動腫瘤進展，使得癌細(xì)胞發(fā)生遺傳與表型變異，衍生ITH，癌細(xì)胞帶著不同的分子特征，對抗癌治療表現(xiàn)出不同的敏感性，進而在治療過程中出現(xiàn)耐藥[9]。如果說遺傳不穩(wěn)定是ITH的啟動劑，那么克隆進化學(xué)說就是維持劑，這一學(xué)說最早在1976年由Peter Nowell提出[10]，不斷擴大的腫瘤細(xì)胞群在遺傳變異的作用下產(chǎn)生多個亞克隆，進一步通過克隆進化實現(xiàn)發(fā)展增殖，在實體腫瘤中多采用分支進化模式，由一個共同祖先產(chǎn)生多個亞克隆進化；而在部分血液腫瘤中則發(fā)生線性進化，通過連續(xù)突變促進有生存優(yōu)勢的進化[11](見圖1,彩插1)。

ITH的出現(xiàn)可能使從單個腫瘤活檢樣本中描繪的基因組圖譜變得局限，同時對疾病生物標(biāo)志物的開發(fā)和對患者個體治療方案的制定提出重大挑戰(zhàn)。在精準(zhǔn)醫(yī)療的大背景下，我們需要以個體為基礎(chǔ)，利用當(dāng)代網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)資源對個體的所有生物學(xué)特性、環(huán)境因素、疾病相關(guān)因素進行有機整合，準(zhǔn)確判斷個體腫瘤發(fā)展?fàn)顟B(tài)，制定真正的個體化治療方案。

2 卵巢癌腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的分子機制

利用基因組測序的手段發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)主要是體細(xì)胞突變及拷貝數(shù)變異導(dǎo)致了腫瘤內(nèi)表型的多樣性。Nakamura K等[12]選取1例67歲高級別漿液性卵巢癌患者，對3個腫瘤區(qū)域中約160個與癌癥相關(guān)的基因突變進行研究，在病理切片中發(fā)現(xiàn)從區(qū)域a到區(qū)域c細(xì)胞核異性程度增加，測序結(jié)果顯示在區(qū)域b和c中ERBB2擴增，拷貝數(shù)(CN)=32(b)、26(c)，而在區(qū)域a中ERBB2僅輕微擴增(CN=6)；在區(qū)域c中檢測到KRAS擴增(CN=4)，但在區(qū)域a和b中未檢測到。在3個不同區(qū)域中觀察到了體細(xì)胞突變的差異及拷貝數(shù)的變異，再一次提示這種腫瘤進化出的亞克隆是阻礙靶向治療的攔路石。對于高級別漿液性卵巢癌，最普遍的遺傳特征是TP53突變，但是在腫瘤發(fā)展中，該基因亦存在錯義突變，發(fā)展出無P53表達(dá)的亞組，并有研究發(fā)現(xiàn)，相比于其他TP53突變的亞型，這類腫瘤預(yù)后更差[13]。為進一步明確無P53卵巢癌的ITH，Alba等[14]選取來自同一患者的6個原發(fā)灶、2個盆腔內(nèi)復(fù)發(fā)灶和4個盆腔外復(fù)發(fā)灶樣本進行全外顯子測序，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)的102個基因突變中只有42個在所有樣本中共有；存在拷貝數(shù)變異的18個基因也僅有7個在所有樣本中檢測到，同時研究者也發(fā)現(xiàn)了其中與卵巢癌復(fù)發(fā)最具相關(guān)性的基因，如GPNMB、TFDP1。

除了最常見的高級別漿液性卵巢癌，在一些特殊類型卵巢癌中亦發(fā)現(xiàn)具有典型的時間(原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的差異)和/或空間(瘤灶內(nèi)部差異)異質(zhì)性。Arnaud等[15]研究發(fā)現(xiàn)成人型卵巢顆粒細(xì)胞瘤是一種罕見的卵巢癌，其潛伏期長，復(fù)發(fā)率高，在對原發(fā)灶和配對復(fù)發(fā)灶行sanger測序后發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)灶中TP53、TET2、MED12等基因發(fā)生突變，表示了與疾病進展和復(fù)發(fā)的相關(guān)性。在一項關(guān)于卵巢透明細(xì)胞癌的研究中，研究者選取6例患者，每個樣本選取4個區(qū)域進行全基因組測序，共發(fā)現(xiàn)七千多個體細(xì)胞突變，112個拷貝數(shù)變異，作者指出這種基因突變驅(qū)動的ITH對腫瘤的分子檢測和靶向治療具有重要意義[16]。隨著測序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，越來越多的研究利用全外顯子測序、單細(xì)胞測序、T細(xì)胞受體測序等手段對ITH進行探究[17-19]，不僅揭示了腫瘤內(nèi)不同區(qū)域的克隆進化，更闡明了異質(zhì)性發(fā)生的分子機制，指出重要突變和拷貝數(shù)變異作為潛在治療靶標(biāo)的重要性。

3 卵巢癌腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的系統(tǒng)進化與量化

腫瘤多區(qū)域測序的發(fā)展，使靶向治療逐漸進入臨床醫(yī)生的視野，但在治療過程中出現(xiàn)的耐藥性又日益凸顯出疾病進化研究的重要性，提示需要進一步研究實現(xiàn)對疾病發(fā)展的預(yù)測。Thomas等[20]提出以多區(qū)域測序結(jié)果為基礎(chǔ)，構(gòu)建“系統(tǒng)發(fā)育樹”可以較好地表示患者腫瘤的進化過程，即在腫瘤發(fā)展過程中，癌細(xì)胞的進化并不是遵循順序或線性規(guī)律，而是將每個新產(chǎn)生的突變作為一個分支，最終形成樹狀結(jié)構(gòu)，隨后，可以通過統(tǒng)計數(shù)據(jù)對ITH進行量化，例如總平均樹長，即從樹根到葉節(jié)點的平均突變數(shù)，表示為與樣本數(shù)無關(guān)的平均突變負(fù)擔(dān)。在Lee等[21]的研究中就應(yīng)用了“系統(tǒng)發(fā)育樹”，研究標(biāo)本取自1例71歲的IIIC期卵巢癌患者，共包括7個腫瘤樣本、3個轉(zhuǎn)移樣本，利用全外顯子測序數(shù)據(jù)構(gòu)建“系統(tǒng)發(fā)育樹”，形成兩個原發(fā)腫瘤簇(P1、P2)和一個轉(zhuǎn)移簇(M)，分析比較后發(fā)現(xiàn)P1、P2簇在腫瘤發(fā)育早期就發(fā)生了分化，而M簇中的基因結(jié)構(gòu)與P1簇相似，具有較少的基因突變和拷貝數(shù)變異，從“系統(tǒng)發(fā)育樹”中發(fā)現(xiàn)除了亞克隆進化，腫瘤微環(huán)境也可能通過分泌一些誘導(dǎo)因子促進腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。有一種觀點認(rèn)為輸卵管病變是卵巢癌的前體病變[22]，為明確疾病順序，Jeremy等[23]利用4例患者的9個不同區(qū)域進行二代測序以分析單核苷酸變異，構(gòu)建卵巢腫瘤和腹腔轉(zhuǎn)移腫瘤的“系統(tǒng)發(fā)育樹”，量化突變分支與樹根距離后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移分化發(fā)生于早期，且與原發(fā)腫瘤突變相似，進一步證明卵巢癌起源于輸卵管病變的觀點。

為明確腫瘤內(nèi)亞克隆導(dǎo)致的異質(zhì)性是否與患者預(yù)后相關(guān)，Schwarz等[24]開發(fā)了用于腫瘤內(nèi)拷貝數(shù)比較的最小事件距離算法對ITH的系統(tǒng)進化進行定量分析，共納入14例接受鉑類藥物治療患者的135個樣本進行全基因組測序，量化結(jié)果用腫瘤間克隆擴增程度(clonal expansion，CE)表示，以中位數(shù)0.74將樣本分為高CE組和低CE組，比較后發(fā)現(xiàn)每位患者均表現(xiàn)出很高的異質(zhì)性，同時觀察到CE值與患者預(yù)后相關(guān)，即與低CE組相比高CE組生存期較短(總生存期：12.7月vs 42.6月；無進展生存期：10.1月vs 23.5月)。綜上可見，“系統(tǒng)發(fā)育樹”可以較準(zhǔn)確地描繪腫瘤的進化軌跡，結(jié)合“系統(tǒng)發(fā)育樹”的量化可以作為腫瘤的預(yù)后指標(biāo)。

4 卵巢癌腫瘤異質(zhì)性的臨床意義

最具治療前景的分子靶向療法是基于單一樣本的基因組圖譜分析，找出疾病發(fā)生的關(guān)鍵基因?qū)⑵湟暈榘┌Y驅(qū)動因子，針對關(guān)鍵基因進行的靶向治療，但是研究發(fā)現(xiàn)，盡管初期治療反應(yīng)良好，后期幾乎所有癌癥都會對靶向藥物產(chǎn)生耐藥[25-27]。耐藥性是患者長期生存的一大威脅，同時也是醫(yī)生進行治療的一大難題，這主要是ITH造成的，如果對異質(zhì)性進行更深入的研究，或許能克服這一困難，同時開發(fā)異質(zhì)性在腫瘤診斷及治療方面的作用，可為卵巢癌患者帶來福音。在Takaya等[28]的研究中揭示了異質(zhì)性與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系，通過TCGA數(shù)據(jù)庫納入502例基因芯片數(shù)據(jù)，利用克隆指數(shù)(cloning index，CI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)得分對異質(zhì)性量化，將病例分為4組：高CI/高LOH組、高CI/低LOH組、低CI/低LOH組、低CI/高LOH組，無進展生存期分別為：16.8月、16.6月、15.0月、22.6月；總生存期分別為：49.5月、38.6月、38.6月、55.1月，其中低CI/高LOH組預(yù)后最佳，由此可見ITH與卵巢癌預(yù)后顯著相關(guān)，有望利用ITH量化手段構(gòu)建預(yù)后預(yù)測模型，指導(dǎo)臨床治療。在診斷方面，Choi等[29]對卵巢癌樣本和腹水癌細(xì)胞的全外顯子測序分析后首次發(fā)現(xiàn)腹水癌細(xì)胞通過整合ITH可以重建整個卵巢癌的基因組，由此推斷可將其作為發(fā)現(xiàn)對卵巢癌具有診斷和治療意義的體細(xì)胞突變的潛在資源。傳統(tǒng)靶向治療產(chǎn)生耐藥的機制認(rèn)為主要是由“系統(tǒng)發(fā)育樹”中分支亞克隆突變驅(qū)動產(chǎn)生的，對于ITH，靶向單個優(yōu)勢克隆或許會破壞各亞克隆間原有的相互作用，研究者認(rèn)為可以依據(jù)“系統(tǒng)發(fā)育樹”中的突變次序，采取順序或組合靶向治療策略，從而有效延長患者生存期[30]。

5 小結(jié)

卵巢癌惡性程度高、發(fā)現(xiàn)晚、易復(fù)發(fā)和耐藥的特性嚴(yán)重影響患者生理、心理。綜合本文所述，ITH在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，越來越多的研究揭示了異質(zhì)性與耐藥的相關(guān)性，同時，更多的證據(jù)指出異質(zhì)性的量化與卵巢癌不良預(yù)后有關(guān)。因此，明確ITH的發(fā)生機制有助于尋找疾病發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動因子，結(jié)合基因組學(xué)研究描繪疾病發(fā)展軌跡，是預(yù)判后期進展、指導(dǎo)臨床治療的最具潛力的途徑。為實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療，我們需要進一步了解腫瘤內(nèi)關(guān)鍵驅(qū)動基因及其異質(zhì)性的變化，探索腫瘤進化史，研究異質(zhì)性與腫瘤微環(huán)境的相互作用，尋找促進腫瘤發(fā)展的規(guī)律，探索順序或組合靶向治療手段，為新靶向治療提供研究基礎(chǔ)。