肝膽類器官在中藥研究中的應用進展

丁明寧，薛曉勇，李曉驕陽

北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 100029

類器官是一類由干細胞誘導培養(yǎng)生成，可高度模擬體內組織和器官生物學特性的體外研究平臺，可應用于不同組織和器官生理、病理及藥物作用過程的研究。目前有研究發(fā)現(xiàn)，通過對多能干細胞（pluripotent stem cell，PSC），包括胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導多能干細胞（human-induced pluripotent stem cell，iPSC），以及部分特定來源的成體干細胞進行誘導[1-2]，可形成具有特定組織功能的類器官。這些類器官在維持組織器官的功能和修復其損傷等方面具有巨大的應用潛力。相較于傳統(tǒng)研究中廣泛使用的永生細胞系和原代細胞，類器官不僅具有細胞系增殖能力強的特點，而且其表型類似于從體內分離而來的不可增殖的原代細胞。同時，研究人員從健康人或病人身上獲取體細胞，通過不同的誘導分化方法，將其進一步培養(yǎng)分化成為特定的類器官，以更好地模擬器官的生物學功能。目前，已有腸道[3]、視網(wǎng)膜[4]、腦[5]、腎[6]、胰腺[7]和肺[8]等健康組織，甚至包括一些腫瘤組織[9]的類器官被建立，這為基礎研究、新藥篩選及藥物開發(fā)提供了更多體外研究平臺以供選擇。

肝臟作為人體眾多生理過程中的重要樞紐，在營養(yǎng)素以及外源性物質（如藥物）的代謝，膽汁酸、脂質和膽固醇穩(wěn)態(tài)的維持，生長信號通路的內分泌調控，造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能的支持等生理活動中意義重大[10]。肝臟由肝實質細胞（如肝細胞）以及多種非實質細胞（如膽管細胞、肝星狀細胞、肝臟巨噬細胞等）組成。過去的研究多基于細胞系進行肝細胞體外研究，如可長期擴增的肝癌HepG2細胞，但其結果和體內試驗不能完全一致；部分正常人肝細胞系（如L02細胞等）已不推薦使用；原代肝細胞相對肝臟細胞系，可較好反映體內肝細胞的實際功能，但其易凋亡且無法增殖，難以實現(xiàn)長期培養(yǎng)。雖然在3D膠原培養(yǎng)介質上培養(yǎng)原代肝細胞可在一定程度上延長其體外培養(yǎng)時間，但以上細胞模型僅涉及單一肝細胞，而忽視了肝臟中其他非實質細胞所發(fā)揮的重要功能，如膽管細胞等。在肝臟病生理及藥理的體外研究中，不同于肝原代細胞模型，干細胞可通過多種途徑被誘導，在傳代后仍保持染色體穩(wěn)定的前提下，分化為細胞形態(tài)完整、功能完善的肝細胞或膽管細胞，并逐步形成肝膽類器官來模擬肝組織功能，解決了用原代肝細胞長時間培養(yǎng)費用較高，人肝組織難以獲取等問題。

目前，藥物篩選和后續(xù)藥物體內評價的實驗周期長、成本高，不利于藥物開發(fā)的快速推進。因此，類器官作為一種可以有效評價藥物藥理毒理作用的體外細胞模型，受到了研究學者的廣泛關注。近年來有研究學者發(fā)現(xiàn)，中藥單體可在多種類器官模型上進行藥物評價，Chen等[11]構建了小腸類器官，發(fā)現(xiàn)甘草次酸可通過提高人抗原R（human antigen R，HuR）以及下游增殖細胞核抗原Ki67（proliferation- associated nuclear antigen Ki67）的水平促進小腸類器官的發(fā)育，維持腸上皮細胞穩(wěn)態(tài)，利于藥物吸收。Li等[12]構建了非小細胞性肺癌患者來源的肺癌類器官，發(fā)現(xiàn)小檗堿對人肺癌類器官敏感，白屈菜紅堿、甜菜堿、斑蝥素對人肺癌類器官有抗癌活性。由此可見，類器官體外模型作為一種中藥藥物篩選及毒性評價平臺，具有很高的應用價值。中醫(yī)認為，肝乃將軍之官，具有生發(fā)，喜條達，惡抑郁，體陰而用陽的功能特點；主筋而藏血，其華在爪，開竅于目，主疏泄，并與膽相表里[13-14]。中藥藥效的發(fā)揮離不開肝臟正常的生理功能，同時作為中藥主要的代謝器官，藥物的效毒作用也可影響肝臟的生理狀態(tài)。因此，應用類器官模型作為藥物篩選及臨床前評價平臺來考察藥物對肝臟的保護及毒性作用意義重大。肝膽類器官模型作為一種肝臟系統(tǒng)的綜合評價體系，在評價中藥效毒作用方面具有天然的優(yōu)勢，該模型不僅可以模擬生理狀態(tài)下肝臟中多細胞間的相互作用，還可以通過現(xiàn)代細胞生物學技術，準確、高效地反映藥物的作用機制，為新藥開發(fā)、藥物評價及臨床用藥等提供新的策略方案。

1 不同來源肝或肝膽類器官的分化過程

干細胞分化形成肝或肝膽類器官通常需要以下4個步驟：內胚層細胞的誘導、內胚層向類肝細胞分化、類肝細胞的擴增和成熟。先由干細胞誘導生成定型內胚層細胞（definitive endoderm，DE），然后對DE進一步的誘導，使細胞分化發(fā)育為肝母/肝祖細胞，肝母/祖細胞可進一步增殖分化為成熟的類肝細胞或類膽管細胞，最后形成肝膽類器官體系。用于肝膽類器官分化研究的干細胞主要有ESC、iPSC以及成體干細胞，而不同來源的干細胞誘導分化的過程略有差異。

ESC可進行自我復制并能無限增殖，不同的研究人員利用這一特性對ESC進行誘導分化，得到了肝類器官和具有雙分化潛能的肝膽類器官。Cai等[15]通過在培養(yǎng)基中加入激活素a（activin A，Act A），誘導ESC形成DE，隨后加入含有成纖維細胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，F(xiàn)gf4）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，Bmp2）的培養(yǎng)基，促進DE向肝細胞分化，最后給予肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，Hgf）、抑癌蛋白M（oncostatin M，Osm）和地塞米松（dexamethasone，Dex）等因子促進肝細胞的成熟。該細胞體外培養(yǎng)10 d后可表達人肝細胞的標志物白蛋白（albumin，Alb）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，Afp）、角蛋白8（cytokeratin 8，CK8）、CK18等，并且在移植到四氯化碳肝損傷的小鼠體內后，可表達人α-抗胰蛋白酶2周以上。此外，培養(yǎng)環(huán)境的變化也會影響肝膽類器官的分化過程。早期研究多采用平面培養(yǎng)，后來發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)可以進一步完善類器官的功能并提高類器官的肝分化成熟度。Ogawa等[16]發(fā)現(xiàn)通過3D培養(yǎng)和激活環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）通路可以促進ESC誘導形成的肝母細胞向類肝細胞轉化，且cAMP在分化早期通過內胚層的激活素節(jié)點對肝母細胞進行調節(jié)。Rashidi等[17]發(fā)現(xiàn)采用2D培養(yǎng)誘導ESC得到的類肝組織類似于胚胎肝細胞，其肝臟特異性基因表達不穩(wěn)定，實際應用價值較差。在應用3D培養(yǎng)技術后，得到了穩(wěn)定表達肝臟特異性基因的3D肝類器官，該類器官不僅可以在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，還能促進肝部分切除小鼠的肝功能恢復。相比2D培養(yǎng)，3D培養(yǎng)得到的類器官更加成熟且功能穩(wěn)定。Wang等[18]通過Act A和MMTV整合位點家族成員3A（wingless-type MMTV integration site family,member 3A，Wnt3A）誘導ESC分化生成DE后，加入含Bmp4和Fgf4的培養(yǎng)基，在2D培養(yǎng)的條件下限制誘導分化為肝細胞譜系的細胞，并表達肝祖細胞的多個標志物。另外，該研究團隊首次發(fā)現(xiàn)，這種肝膽類器官不僅具有雙分化潛能，其中的單細胞還能重構形成新的具有雙分化潛能的肝膽類器官。

iPSC是由體細胞通過細胞融合[19]、核移植[20]、多潛能因子表達[21]進行重編程而成，類似于ESC的干細胞[22]。Zhao等[23]從成人包皮提取出成纖維細胞用以誘導iPSC細胞，以堿性磷酸酶染色陽性和質粒轉染的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達陽性為標準，鑒定由成纖維細胞重編程形成的iPSC細胞成功分化。一般來說，iPSC可誘導分化為高純度的DE，并產(chǎn)生由多能干細胞衍生的單層肝細胞。Song 等[22]將含有八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor-4，Oct-4）、性別決定區(qū)Y框蛋白2（sex-determining region Y-box 2，Sox2）、Kruppel樣因子4（kruppel-like factor 4，Klf4）和未分化胚胎細胞轉錄因子1（undifferentiated embryonic cell transcription factor-1，Utf1）的質粒轉染到成人包皮提取出來的成纖維細胞中[23]，進行體細胞重編程并建立iPSC細胞系。隨后他們首次在iPSC細胞分化的不同階段：內胚層誘導（Act A）、肝分化（Fgf4、Bmp2）、肝母細胞增殖[Hgf、角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，Kgf）]與肝成熟（Osm、Dex、N2B27）加入相應的誘導劑，誘導iPSC分化生成肝樣細胞。但以上方法分化得到的肝樣細胞類型單一，難以模擬肝臟中細胞和組織間復雜的信號通路。Vyas等[24]通過胚胎肝祖細胞和肝細胞外基質共培養(yǎng)得到了具有膽管樣結構的肝細胞，提出了多細胞共培養(yǎng)分化肝膽類器官的研究方向。近年來也有研究采用了內胚層細胞、上皮細胞和間葉細胞祖細胞共同培養(yǎng)的方式，得到了功能更為完善的肝芽樣結構[25]。Gieseck等[26]還發(fā)現(xiàn)通過3D培養(yǎng)和高通量篩選的方式，可提高iPSC所誘導的肝細胞的成熟度。通過對患者的體細胞進行重編程形成iPSC，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯并移植到患者體內后，可用于遺傳性疾病的治療，同時避免了倫理學爭議和排異反應的發(fā)生[27]。Wu等[28]在最近的一項研究中，首次在不使用其他基因或外源性細胞的情況下，僅用含有25%的mTeSR的肝分化培養(yǎng)基對內胚層細胞和小部分中胚層細胞共同誘導的方式，將iPSC誘導形成具有肝膽功能的類器官，且這種分化方式可推遲早期肝細胞分化，而在激活Notch2和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，Tgf-β）信號通路后，可促進iPSC向膽管細胞分化的過程。

此外，還有直接來源于肝膽細胞的類器官。Sato等[29]發(fā)現(xiàn)提取自小腸隱窩的亮氨酸重復序列G蛋白偶聯(lián)受體5+（leucine-rich repeat-containing G-protein- coupled receptor 5+，Lgr5+）的肝干細胞可在體外誘導形成腸絨毛樣上皮所有類型的細胞，形成具有層級結構的Lgr5+腸上皮類器官。隨后發(fā)現(xiàn)Lgr5+膽管來源的具有祖細胞潛能的肝干細胞不僅能在體內外分化形成功能性肝細胞，還能在體外形成上皮類器官[30]。

2 不同來源肝或肝膽類器官的分化評價

在肝膽類器官誘導形成的過程中，可在轉錄水平、細胞水平及功能水平上，通過檢測特異性基因的表達、細胞形態(tài)及功能、移植后再生能力等方面對肝膽類器官的分化效率進行評價。

無論是ESC、iPSC或肝膽細胞來源的肝或肝膽類器官，在進入肝分化誘導階段后，對類器官形態(tài)和功能的評價指標相類似。在分化的早期階段，通過定型內胚層特異性蛋白叉頭框蛋白A2（forkhead box protein A2，F(xiàn)OXA2）和Sox17確定干細胞是否成功分化為DE；在肝分化誘導階段，可檢測肝細胞核受體4a（hepatocyte nuclear factor 4a，Hnf4a）、T-框轉錄因子3（T-box transcription factor 3，TBX3）、CCAAT/增強子結合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPA）、CEBPB、Sox9、CK19和鈣調蛋白（calmodulin，CAM）等基因的表達，來確定肝細胞是否分化；在肝成熟和擴增階段，通過檢測組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）、法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、孕甾烷X受體（pregnane and xenobiotic receptor，PXR）、細胞色素P450家族2亞家族C成員9（cytochrome P450 family 2 subfamily C member 9，CYP2C9）、CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1等特異性基因的表達，來判斷細胞是否被誘導分化為成熟肝細胞。此外，原代肝細胞作為成熟肝細胞，其表達的多種藥物代謝標志物(CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2A6、CYP2C8、CYP2C9和CYP2D6），常用以評估誘導分化所得的類器官模型是否誘導為成熟的肝細胞。肝膽類器官具有雙分化潛能，可分化成肝細胞和膽管細胞[31]，在檢測肝細胞特異性基因表達的基礎上，通過檢測膽管細胞標志物如上皮黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）、囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、谷氨酰胺轉移酶（glutamine transferase，GGT）、水通道蛋白（aquaporin-2，AQP）、α1抗胰蛋白酶（alpha1-antitrypsin，AAT）、CK8、CK18和CK19、轉運蛋白如頂膜鈉依賴性膽鹽轉運體（apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT）、脂肪酸結合蛋白6（fatty acid binding protein 6，F(xiàn)ABP6）和多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance- associated protein，MRP3）和膽管細胞相關轉錄因子如SOX9、發(fā)狀分裂相關增強子1（hairy enhancer of split 1，HES1）、Hnf6和Hnf 1b的表達水平來確定肝膽類器官中膽管細胞的功能水平和分化程度。在2D培養(yǎng)條件下，Wang等[18]在肝分化誘導階段使用了肝特異性培養(yǎng)基對DE進行誘導，通過鑒定肝干/母細胞的特異性的基因表達（Hnf 4a、CK19、EPCAM、SOX9、Afp），確定類器官成功進行類肝分化。為了確定類器官的分化階段及并建立基因表達譜，從而建立類器官發(fā)育階段的評價體系，研究人員對ESCs來源的肝系細胞、肝母細胞、成人肝細胞誘導形成的類器官和人源胚胎干細胞誘導的肝類器官（human embryonic stem cell-derived expandable hepatic organoids，hEHO）進行聚類分析。研究發(fā)現(xiàn)所得hEHO會上調轉錄因子和早期肝臟發(fā)育調節(jié)因子如prospero相關盒蛋白1（prospero homeobox 1，PROX1）、單切域家族2（One cut domain family member 2，ONECUT2）、SOX9、FGF受體4（FGF receptor 4，F(xiàn)GFR4）、FOXA1和FOXA3；上調Wnt信號通路的成分如LGR5、鋅指蛋白3（zinc and ring finger 3，ZNRF3）、環(huán)指蛋白43（ring finger protein 43，RNF43）、AXIN2、CD44、dickkopf Wnt 信號通路抑制劑1（dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 1，Dkk1）、Wnt7A和Wnt7B，并且肝母細胞表達標志物（SOX9、EPCAM、CK19、Hnf4a、TBX3和Afp）呈陽性，其多能標志物有OCT4和SOX2則陰性表達。所以，根據(jù)該基因表達譜認為hEHO的1～3代的表型類似于新生階段的肝細胞：ESCs來源的肝系細胞和肝母細胞，具有肝干/母細胞的分化潛力，而hEHO移植進免疫缺陷的老鼠的附睪后，能分化形成肝系的肝母細胞、成熟肝細胞和早期的膽管上皮細胞，且不會產(chǎn)生畸形瘤。

在誘導形成類器官的過程中，還可以通過觀察細胞形態(tài)來評估類器官的分化效率。iPSC呈圓形克隆團塊生長，團塊內細胞形狀大小不一致[32]。在分化誘導后，會形成肝細胞樣粒狀上皮細胞和扁平胞質透明細胞，再分化形成膽管細胞和肝細胞[33]。肝膽類器官中可觀察到具有多邊形輪廓、細胞質空泡以及圓形細胞核的肝細胞，和空心囊狀或空心管樣結構的膽管細胞。肝臟具有分泌和排泄膽汁，合成糖原、白蛋白及尿素等物質，參與藥物代謝等重要功能，是維持人體正常生理循環(huán)和代謝的關鍵器官。因此，多數(shù)研究通過檢測白蛋白、尿素等的生成含量來評價肝膽類器官的功能。此外，還可通過考察吲哚青綠染色來評價肝細胞的代謝能力，檢測CDFDA染料（被轉運蛋白MRP2水解成CDF后產(chǎn)生熒光）產(chǎn)生的熒光強度來評價肝特異性轉運蛋白的功能，基于PAS染色評價肝糖原的儲存能力等評價肝膽類器官功能。近年來，也有學者[15]在肝類器官培養(yǎng)的上清液中加入HIV-HCV假型病毒，通過檢測熒光素酶含量確認肝類器官對丙肝病毒的易感性，用于考察肝類器官的功能。

肝膽類器官形成后可將其移植到小鼠體內來評價其是否具備成熟肝膽細胞的功能。有研究表明，ESC細胞生成的類器官移植入免疫缺陷的Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠體后，可以分化形成的成熟肝細胞來填充肝實質，在移植到免疫缺陷小鼠的附睪后上沒有產(chǎn)生畸形瘤。若在該類器官中加入人胚胎肝間充質細胞，形成的衍生模型可用于模擬酒精性肝病，并在乙醇處理后可出現(xiàn)氧化應激、單純脂肪變性、炎癥介質釋放和肝纖維化等酒精性肝病相關的生理病理變化[18]。Rashidi等[17]將3D培養(yǎng)得到ESC源的肝類器官移植到C57BL6/J小鼠，以及免疫缺陷的Rag2-/-IL2rg-/-小鼠體內后，發(fā)現(xiàn)接受移植的小鼠在手術2周后恢復到初始體質量，同時檢測到人白蛋白的分泌，天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）以及其他肝損傷標志物表達的下降，證明了該類器官具有成熟的肝組織功能。同時，該學者還采用具有良好耐受性和血管化的PCL電紡支架進行研究，通過給小鼠皮下注射含肝類器官的支架，發(fā)現(xiàn)小鼠肝損傷有所減輕。Takebe等[34]將3D培養(yǎng)下iPSC誘導的肝芽移植到先天免疫缺陷的小鼠體內后，通過活體成像檢測到血流灌注功能的恢復以及其他肝功能逐漸完善。研究人員將Lgr5+的膽管細胞分化形成的肝膽類器官移植到四氯化碳急性損傷的小鼠體內，通過人特異性抗體檢測到人源CK19+的膽管樣細胞群和Alb+/CK19-肝細胞群[30]。

3 基于肝膽類器官評價體系研究中藥的肝臟保護或損傷作用

隨著中藥在世界范圍內的廣泛使用和深入研究，中藥肝保護及肝損傷作用受到廣泛的關注。類器官作為一種由人干細胞誘導分化而來的體外模型，可模擬人體器官發(fā)育的完整生物信息，還可用于研究疾病發(fā)生發(fā)展等病理過程，適用于中藥藥效學和毒理學評價、臨床前藥物篩選和早期毒性評估等。目前，關于中醫(yī)藥對肝膽類器官的作用機制研究主要集中于中藥單體和多種天然藥物。

3.1 中藥在肝膽類器官體系中保肝作用的研究

基于中藥多成分、多靶點的作用特點，從分子水平上精準闡釋中藥復方多組分間藥效機制，有助于推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化發(fā)展。相關研究表明，保肝類中藥具有提高類器官活性及增殖能力等方面的潛力。目前，針對中藥促進肝膽類器官分化或成熟的研究較少?？紤]到膽固醇在肝臟膽汁酸合成中發(fā)揮的重要作用，有研究創(chuàng)新性地篩選了多種中藥活性成分，并與膽固醇按一定比例組合（即膽固醇＋專利中藥復方MIX）。結果顯示，不加膽固醇＋中藥MIX的肝膽類器官在分化25 d時會出現(xiàn)明顯的細胞死亡，其余的肝細胞則發(fā)生形態(tài)改變或者凋亡。而加入膽固醇＋中藥MIX后，類器官的成熟肝細胞及膽管細胞標志物表達增加，其培養(yǎng)時間延長。同時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)中藥復合物處理后的肝膽類器官具有更好的藥物代謝能力、糖原儲存能力和Alb分泌能力，在體內移植4周到8周后，膽固醇＋中藥MIX處理的肝膽類器官可以在體內存活更長時間，并形成肝、膽細胞[28]。這一項研究提出了中藥復方及活性成分對肝膽類器官的保護作用和潛在機制，為以后其他中藥藥物保肝研究指出了全新方向。

3.2 中藥在肝膽類器官體系中毒性作用的研究

藥物肝毒性是藥物開發(fā)過程中藥物安全性的重要評價指標，而肝膽類器官培養(yǎng)不僅是一種新型的細胞培養(yǎng)技術，更具有成為臨床前藥物肝毒性評價模型的潛力。李朋彥等[33]采用3D培養(yǎng)技術培養(yǎng)具有干性潛能的HepaRG細胞株，并誘導生成肝實質細胞和膽管細胞，同時基于此種培養(yǎng)模型體系進行胺碘酮、環(huán)孢霉素的肝毒性評價。由于對中藥的不良反應的忽略和不合理的超劑量濫用，中藥已經(jīng)成為我國藥物性肝損傷的首要原因[35-36]。隨著對中藥藥物作用機制研究的深入，如何合理評價中藥肝毒性成為亟需解決的科研問題，闡釋中藥肝毒機制有助于提高中藥臨床用藥的安全性和合理性。目前，國內已有肝損傷案例報道的中藥有雷公藤、何首烏、吳茱萸、千里光、柴胡等[37-38]，同時，常用的中藥肝毒性評價模型有原代肝細胞、動物模型、類器官等。人肝原代細胞常用于藥物肝毒性評價，但其無法增殖、存活時間短并且獲取及培養(yǎng)成本較高；而動物模型由于種屬差異，不能完全模擬中藥在人體內的效毒作用，同時有研究表明動物對藥物毒性有更高的耐受性，影響了臨床前藥物評估實驗的準確度[39]。人源干細胞誘導分化的肝膽類器官可大量增殖并實現(xiàn)體外長時間培養(yǎng)，且生物學特性均類似于肝原代細胞，同時評價效率高，適用于急、慢性藥物的藥理及毒理評價。

肝膽類器官可用于中藥成分低濃度、長時間暴露所產(chǎn)生的肝毒性評價和機制研究。Kang等[40]利用胚胎干細胞QIA7和誘導多能干細胞WA01誘導的肝細胞評價乙酰氨基酚和黃曲霉素B2的肝毒性。通過多參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，給予對乙酰氨基酚和黃曲霉素B2后，誘導多能干細胞形成的肝細胞和肝原代細胞，在線粒體膜電位、鈣內流和氧化應激的表型變化相似。李婷婷等[41]發(fā)現(xiàn)何首烏的主要活性成分為反式二苯乙烯苷（trans-SG），其體內造成肝損傷的主要物質為順式二苯乙烯苷（cis-SG），采用液滴重疊法對具有干性的HepG2和L02細胞系進行3D培養(yǎng)得到肝類器官，在此肝類器官體系下驗證了cis-SG的肝損傷作用顯著高于trans-SG，同時發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)的類器官模型在重復給藥后，對藥物毒性敏感性增加，符合中藥肝損傷的特點。胡秋艷[32]采用iPSC誘導的肝類器官作為評價藥物肝毒性的模型，發(fā)現(xiàn)該模型可以很好評價雷公藤的肝毒性作用：雷公藤凍干粉的劑量與肝細胞損傷標志物谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、AST及肝細胞膜損傷標志物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的活性均具有一定正相關性，同時，也與抗氧化還原酶谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性具有一定的負相關性，以上雷公藤凍干粉的結果在L02細胞中得到驗證，說明了iPSC誘導的類器官具有評價中藥肝毒性的潛能。Kim等[42]基于流式細胞分析技術，發(fā)現(xiàn)采用2個hESC細胞系BG01和SNUhES4誘導形成肝膽類器官98%為肝細胞（Alb+、HNF4a+）和2%為膽管細胞（EpCAM+、CK7+）。隨后通過細胞增殖能力檢測和生理功能分析 [PAS糖原染色、吲哚菁綠（indocyanine green，IGG）攝取能力、低密度脂蛋白攝取能力] 等方面對此肝類器官進行評價，結果發(fā)現(xiàn)其各項生理功能均與原代肝細胞類似。在類器官模型建立后，給予參照藥物曲格列酮和二甲雙胍，其細胞存活率變化趨勢類似于原代肝細胞。隨后采用肝膽類器官、人源原代肝細胞以及HepG2細胞3個體外評價平臺對白術苷、大黃素、黃獨乙素和沒食子酸的肝細胞毒性進行評估。結果顯示，3個體外評價系統(tǒng)均顯示黃獨乙素不具有肝細胞毒性；顯示白術苷對HepG2細胞具細胞毒性，而對肝原代細胞和肝類器官模型則不具有細胞毒性；顯示大黃素和沒食子酸僅對HepG2細胞有細胞毒性。以上研究證明了肝膽類器官對藥物毒性的評價效果類似于肝原代細胞且優(yōu)于HepG2細胞，更適用于臨床前藥物篩選和藥物評價。

4 結語

由于肝膽類器官可高度模擬體內組織、器官的功能結構和遺傳特征等生物學特性，在中醫(yī)藥領域具有良好的研究前景。目前研究表明，3D培養(yǎng)技術[16]的應用或特殊內源性小分子物質[28]的加入，可能會促進肝膽類器官的成熟分化；通過對多胚層、不同來源的類器官或類器官與其他細胞進行共培養(yǎng)，如共培養(yǎng)干細胞誘導而成的不同胚層的細胞[29]，共培養(yǎng)心肝腎3種來源的類器官[43]，共培養(yǎng)iPSC誘導形成的肝星狀細胞和HepaRG細胞[44-45]，可提高類器官的誘導效率，并用于研究多細胞間交流及疾病機制。復方中藥、單味中藥與中藥單體相比，在肝毒性機制研究上更為復雜，需根據(jù)臨床實際用藥的情況，基于中藥復方進行藥效毒性的精準評價。而肝膽類器官體外培養(yǎng)平臺與大規(guī)模篩選系統(tǒng)的聯(lián)用，有望成為一種高精度、高靈敏度的中藥體外篩選平臺和肝毒性評價平臺。隨著相關技術的發(fā)展和體內外研究的不斷完善，肝膽類器官將為相關肝膽疾病的臨床治療提供有利條件。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突