代謝組學(xué)在骨質(zhì)疏松中的研究進(jìn)展△

劉 云，羅曉婷，李 崇，廖世杰，林成森，李波香，馮文宇，謝天裕*

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.骨科；b.藥學(xué)部，廣西南寧 530021）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）是一種以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的代謝性骨?。?］，可導(dǎo)致骨骼強(qiáng)度的降低以及骨折風(fēng)險的增加［2］。代謝組學(xué)，即在細(xì)胞、組織或整個生物體中對小分子代謝物的綜合分析［5］，而代謝物是細(xì)胞功能的組成部分并參與酶催化反應(yīng)，上游的生物干擾可導(dǎo)致一系列的代謝組學(xué)改變，因此，代謝組學(xué)擁有豐富的信息并被認(rèn)為是最有預(yù)測能力的表型［6］。故代謝組學(xué)作為一種特定生物系統(tǒng)表型的化學(xué)反映，現(xiàn)在經(jīng)常被用于了解疾病進(jìn)展中的病理生理過程，以及尋找各種生物體疾病新的診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物［7］。過去的十年里代謝組學(xué)的研究已成為研究熱點［8］。利用代謝組學(xué)技術(shù)對OP患者進(jìn)行早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療及預(yù)防骨折發(fā)生不但有利于降低患病率，提高患者的生活質(zhì)量，而且有利于減輕患者家庭及社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1 代謝組學(xué)的概述

代謝組學(xué)是對生物樣品在代謝過程中產(chǎn)生的小分子（即代謝物）定量，收集能反映體內(nèi)環(huán)境變化及疾病狀態(tài)的豐富信息并進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步了解探索疾?。?］。代謝組學(xué)的基本步驟主要分為三步：樣品制備、代謝物測定及數(shù)據(jù)分析。

1.1 樣品的制備

由于許多重要的代謝物會在幾秒鐘內(nèi)就會發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)換，因此，若要獲得準(zhǔn)確的代謝物幾乎需要讓細(xì)胞立即停止代謝活動，而經(jīng)典的方法包括冷凍和或酶變性［8］。此外，在提取培養(yǎng)細(xì)胞的代謝物時，最好避免可能改變新陳代謝的操作，如在代謝驟冷之前進(jìn)行制?；蛳礈旒?xì)胞等［10］。而在提取組織標(biāo)本的代謝物時，最好先冷凍再提取，快速冷凍可以在液氮下金屬板之間粉碎組織來實現(xiàn)，且必須注意避免采樣前和采樣期間的代謝變化，因為麻醉等操作都會引起新陳代謝的變化［11,12］。根據(jù)研究報道，受試動物（或患者）即使只是看到實驗者(或醫(yī)生)也可能引起改變新陳代謝的應(yīng)激反應(yīng)［13］，從而導(dǎo)致體內(nèi)代謝物的突變，最終影響組織標(biāo)本代謝物的準(zhǔn)確提取。

1.2 代謝物的測定

代謝組學(xué)中用于測定代謝物的方法大體上主要分為：核磁共振法（nuclear magnetic resonance,NMR）、質(zhì)譜法（mass spectrometry,MS）及色譜法（chromatographic）。在代謝組學(xué)的早期，一維核磁共振通常被用來生成代謝組學(xué)譜，而其中的大多數(shù)反映了多種代謝物的綜合信號，由于核磁共振在闡明結(jié)構(gòu)和測量體內(nèi)代謝物方面的能力較強(qiáng)，使其在如今的代謝組學(xué)中仍發(fā)揮重要作用［8,14-17］。質(zhì)譜具有發(fā)現(xiàn)和表征新型生物標(biāo)志物的潛力，在檢測低濃度代謝物且不受親緣關(guān)系較近的物種干擾方面具有無與倫比的能力，加上現(xiàn)代質(zhì)譜儀卓越的分辨能力和靈敏度，使得質(zhì)譜在代謝組學(xué)研究中發(fā)揮重要作用［8,18］。然而，在進(jìn)行質(zhì)譜分析時需要將代謝物電離，而電離過程中離子間存在競爭性，且高電離能量可以將某些代謝物分解成與其他代謝物相同的片段，所以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析會存在許多錯漏，而通過在質(zhì)譜測量前在色譜柱上對分析物進(jìn)行物理分離，可降低離子間的競爭，且色譜法的另一個優(yōu)點是使同分異構(gòu)體分離，色譜的加入提高了對低濃度代謝物的檢測，也提高了質(zhì)譜的定量準(zhǔn)確性及代謝組學(xué)的覆蓋率［8,19-22］。根據(jù)研究報道，色譜種類較多，比如：高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）、超高效液相色譜法 （ultra high performance liquid chromatography,UHPLC）、超高壓液相色譜法（ultra-high-pressure liquid chromatography,UHPLC）、反相液相色譜法（reversed phase liquid chromatography,RPLC）、親水作用液相色譜法（hydrophilic interaction liquid chromatography,HILC）等，而質(zhì)譜與色譜通常又是聯(lián)用的，如氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）及液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS） 等［8,23,24］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析的第一步是數(shù)據(jù)的處理：將原始的質(zhì)譜數(shù)據(jù)制作成帶注釋的表格，以便描述樣本的峰值意義和強(qiáng)度；接下來解釋數(shù)據(jù)中強(qiáng)度和濃度之間的關(guān)系，同時還需發(fā)現(xiàn)代謝物在不同條件下發(fā)生的顯著變化；然而，在不同的化合物中，反應(yīng)的影響因素(如電離效率等)有很大的不同，因此，代謝物絕對定量需要與標(biāo)準(zhǔn)定量進(jìn)行比較，且由于許多代謝物沒有同位素標(biāo)準(zhǔn)而使其更容易被貼上標(biāo)簽，所以最好的方法是在淬火時加入同位素標(biāo)準(zhǔn)以便追蹤［8,25,26］。

2 代謝組學(xué)在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用

OP的發(fā)病機(jī)制從大體上可以理解為骨吸收和骨形成之間的平衡由于某些病因被破壞后，使得骨吸收量超過骨形成量導(dǎo)致骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞而導(dǎo)致骨脆性增加且易發(fā)生骨折。根據(jù)目前的研究進(jìn)展，OP的發(fā)病與機(jī)體代謝的變化有很大關(guān)系，而應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究其具體發(fā)病機(jī)制也已成為熱點。

根據(jù)對去卵巢大鼠OP模型的研究發(fā)現(xiàn)，改變的代謝物主要涉及能量、脂質(zhì)及氨基酸等的代謝［27］，利用代謝組學(xué)和電子顯微鏡檢測到與3個月大的小鼠相比，13個月大的小鼠代謝物中的6-碳和3-碳糖的糖酵解中間體數(shù)量均顯著增加，然而線粒體三羧酸循環(huán)中間體的數(shù)量沒有顯著變化，同樣NAD+/NADH比值下降以及核苷酸代謝障礙，極可能表明線粒體功能受損導(dǎo)致糖酵解轉(zhuǎn)移而出現(xiàn)能量代謝障礙，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，所以氧化代謝在衰老的骨骼中受損最終導(dǎo)致骨質(zhì)丟失進(jìn)而發(fā)展成OP［28］。有研究發(fā)現(xiàn)，在將雌二醇應(yīng)用于破骨細(xì)胞（RAW264.7）增殖及分化的抑制實驗中，采用UHPLC-MS技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)RAW264.7內(nèi)27種代謝物的水平均發(fā)生改變，其中LPC的水平顯著降低，同時降低的還有甲烷二羧基醛（MDA）、活性氧(ROS)、其他脂質(zhì)和氨基酸衍生物等，而升高的主要為磷脂酰膽堿-甾醇?；D(zhuǎn)移酶(phosphatidylcholine-sterolacyl transferase,LCAT)及超氧化物歧化酶（SOD）等［29］。其中，LPC可以上調(diào)黏附分子和多種編碼生長因子和環(huán)氧合酶-2的基因的表達(dá)，通過這些基因調(diào)控可促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖和分化,而LCAT是LPC代謝過程中的關(guān)鍵酶，在RAW264.7的增殖和分化抑制實驗中均發(fā)現(xiàn)LCAT被雌二醇上調(diào)，LCAT的高表達(dá)可以分解LPC形成膽固醇酯而導(dǎo)致后者的表達(dá)顯著降低，從而抑制了RAW264.7的增殖分化；此外有研究報道已證實氧化應(yīng)激和抗氧化能力與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，氧化應(yīng)激可引起成骨細(xì)胞損傷和破骨細(xì)胞增殖，相反氧化應(yīng)激的降低會導(dǎo)致破骨細(xì)胞損傷，由于MDA、ROS的降低和SOD的上升僅在RAW264.7的增殖抑制的實驗中觀察到，故氧化應(yīng)激的降低可能只抑制了RAW264.7的增殖［29-31］。另有研究報道，通過脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)小鼠OP的發(fā)生與多種脂質(zhì)代謝變化［比如OP模型組的溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholines，LPC）、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine,PC）及游離脂肪酸的水平明顯升高］有關(guān)，包括脂酰、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂和甾醇等，通常在一般情況下，機(jī)體可將氧化和抗氧化維持在動態(tài)平衡范圍內(nèi)，不會因活性氧過多而造成損傷，然而脂質(zhì)代謝紊亂不但導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生過多而增強(qiáng)了機(jī)體的氧化應(yīng)激，從而超出機(jī)體的自我抗氧化防御能力使骨組織細(xì)胞受到破壞，還可抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化，另外可通過RANKL的作用促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖和分化，最后導(dǎo)致骨質(zhì)流失造成 OP［32,33］。根據(jù)Ye等［34］的研究，去卵巢大鼠血清中的?；撬犸@著下降，而在Xue等［27］的研究中發(fā)現(xiàn)?；撬岷凸劝滨０返乃骄陆得黠@，且二者的研究均證實氨基酸的代謝障礙與OP的發(fā)病密切相關(guān)。此外，已被證明與骨重建和骨骼發(fā)育呈正相關(guān)的牛磺酸是半胱氨酸的氧化產(chǎn)物，具有抗氧化活性，可以減輕動物和人類的氧化應(yīng)激，且由于其可以與二價陽離子結(jié)合，這對骨重建和骨發(fā)育以及避免OP的發(fā)生至關(guān)重要［33,34］。而谷氨酸與半胱氨酸還有甘氨酸通過肽鍵形成谷胱甘肽［33］，后者是谷氨酰胺的代謝副產(chǎn)物，可作為一種氧自由基清除劑在維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)方面發(fā)揮重要作用，可以保護(hù)正常器官組織免受氧化應(yīng)激損傷［35-37］。由此可知，?；撬崤c谷氨酰胺發(fā)生代謝障礙后致使二者在機(jī)體中的水平下降，隨后機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力也因此下降，最后使得骨細(xì)胞被破壞而導(dǎo)致OP的發(fā)生。

所以，OP的發(fā)生發(fā)展與能量、脂肪、蛋白質(zhì)及核苷酸等的代謝障礙密不可分，從代謝角度去認(rèn)識代謝物變化與OP間的關(guān)系并探索關(guān)鍵的代謝物、信號通路及相關(guān)靶點等，可為明確其具體的發(fā)病機(jī)制、臨床的預(yù)防及診療策略的制定等提供極大的幫助。

3 代謝組學(xué)在骨質(zhì)疏松生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用

正常的骨轉(zhuǎn)換涉及骨吸收和骨形成過程之間的平衡，在這一過程中破骨細(xì)胞通過酸化和蛋白水解消化去除（再吸收）骨，而成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)（骨的有機(jī)基質(zhì)）進(jìn)入再吸收腔［38］。如果由于某些病因使平衡被打破，就會使得破骨細(xì)胞相對活躍而導(dǎo)致OP，通過代謝組學(xué)技術(shù)檢測在這一過程中血液及尿液中的某些標(biāo)志性代謝產(chǎn)物的變化，將有可能對OP發(fā)病的預(yù)測及早期診斷提供幫助。

有研究發(fā)現(xiàn)，在對潑尼松龍誘導(dǎo)的OP大鼠模型的尿液使用HPLC-MS非靶向尿液代謝組學(xué)方法檢測代謝產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)，肌酐、?；撬?、甜菜堿、次黃嘌呤和胞嘧啶等是主要潛在的生物標(biāo)志物，肌酐和甜菜堿在氨基酸代謝和能量代謝中起重要作用，牛磺酸是一種具有抗氧化作用的半必需氨基酸，能降低動物和人類的氧化應(yīng)激，而且次黃嘌呤和胞嘧啶也參與能量代謝［23］。此外，同樣是在使用強(qiáng)的松誘導(dǎo)OP的大鼠尿中利用代謝組學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)檸檬酸和n-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺含量降低可能與線粒體功能缺陷有關(guān)［39］。由此可知，以上標(biāo)志物水平的改變提示了細(xì)胞的能量、氨基酸及核苷酸等的代謝障礙和氧化應(yīng)激紊亂與OP的發(fā)生密不可分。另有研究發(fā)現(xiàn)，對364名絕經(jīng)前后中國婦女的血清使用GC-MS技術(shù)檢測代謝物水平時發(fā)現(xiàn)，由于5種游離脂肪酸的濃度變化與骨密度的變化密切相關(guān)，其分別為：油酸、亞油酸、花生四烯酸、11，14-二十碳二酸，而上述5種血清代謝物在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女中的水平顯著高于絕經(jīng)前骨質(zhì)正常婦女中的水平［40］。所以，脂質(zhì)代謝障礙與OP密切相關(guān)，說明脂質(zhì)代謝譜對于OP的預(yù)測及早期診斷也有極大的幫助。無獨有偶，在對去卵巢大鼠OP模型的研究中發(fā)現(xiàn)，模型組的戊二酰肉堿、LPC（18:1）和9-順式維甲酸與對照組相比顯著降低，也提示脂質(zhì)的代謝障礙與OP有關(guān)，值得一提的是模型組中水平下降的9-順式維甲酸（維甲酸的一種）可使大鼠的骨量下降［41,42］。而在另一個同樣是對去卵巢大鼠的OP模型研究中發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，甲烷、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝以及半乳糖的代謝均與骨質(zhì)疏松的發(fā)病密切相關(guān)［43］。還有研究發(fā)現(xiàn)，男性血清代謝物中的精氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和肌氨酸等的水平變化以及絕經(jīng)后女性血清代謝物中的精氨酸、甘氨酸、羥脯氨酸等的水平變化均與骨密度的變化息息相關(guān)，同時結(jié)合肉堿在前二者的血清代謝物中的水平變化可知氨基酸及脂質(zhì)的代謝障礙和OP的發(fā)生緊密相關(guān)［44］，此外將代謝物變化和傳統(tǒng)的骨轉(zhuǎn)化標(biāo)志聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高對OP的敏感性和早期診斷能力。

所以，結(jié)合上述的生物標(biāo)志物和相關(guān)細(xì)胞能量、脂質(zhì)、氨基酸及核苷酸等的代謝障礙可看出前二者和OP的發(fā)生密切相關(guān)，同時確證以及繼續(xù)尋找新的生物標(biāo)志物不但對OP的早期預(yù)測、診斷和預(yù)防骨折有極大的意義，而且有利于進(jìn)一步探索OP的發(fā)病機(jī)制。

4 代謝組學(xué)在藥物干預(yù)骨質(zhì)疏松機(jī)制研究中的應(yīng)用

根據(jù)研究報道，利用核磁共振檢測激素誘導(dǎo)的OP大鼠血清中的代謝物時發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)和乳酸的水平升高，肌酸/肌酐、PC、甘油磷脂酰膽堿（GPC）、牛磺酸、甘氨酸-葡萄糖的水平降低，而與治療組對比發(fā)現(xiàn)淫羊藿逆轉(zhuǎn)了上述代謝途徑中的能量、脂質(zhì)、氨基酸、磷脂代謝和腸道微生物紊亂，提示淫羊藿對改善OP有顯著的治療作用［45］。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補血湯(DBT)是一種常用來緩解PMOP的中藥湯劑，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞經(jīng)DBT中的有效成分毛蕊異黃酮（calycosin）處理后，采用半制備HPLC對其代謝物檢測時發(fā)現(xiàn)成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)顯著增加，而當(dāng)calycosin耗損時，DBT激活的Wnt/b-catenin和MAPK/Erk以及相關(guān)信號通路受到很大的影響，表明calycosin可能是DBT中不可或缺的化學(xué)物質(zhì)，可以協(xié)調(diào)DBT的多種成分，實現(xiàn)最大的成骨性能［46］。還有研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸可通過調(diào)節(jié)亞油酸以及氨基酸等的代謝促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，增加骨形成，防止骨質(zhì)丟失，增加骨密度［47］，而熟地黃則主要通過干預(yù)類固醇激素的生物合成及調(diào)節(jié)氨基酸代謝，從而改善松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，提高骨密度，改善骨代謝穩(wěn)態(tài)［48］。但由于目前研究的藥物大多數(shù)為中藥單體，其具體的有效成分尚未明確，而針對有效成分的進(jìn)一步研究對于抗OP藥物的研發(fā)至關(guān)重要。

5 代謝組學(xué)在骨折疏松研究中的展望

目前對于OP發(fā)病機(jī)制的闡述需要進(jìn)一步完善，而抗OP藥物的研發(fā)尚處于起步階段。然而，代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用可更深入地研究OP的發(fā)病機(jī)制，尋找并確定與診斷相關(guān)的生物標(biāo)志物，這對于早期預(yù)測及早期診斷OP，防止早期的骨質(zhì)丟失，預(yù)防骨折以及預(yù)后的評價有重大意義。此外，利用代謝組學(xué)技術(shù)探索與OP相關(guān)的代謝途徑、信號通路及特點靶點對于藥物的研發(fā)也極其重要。