植物花藥發(fā)育調(diào)控基因AMS的研究進展*

趙重燕，暴會會，杜康華，楊正安，楊 飛

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南生物多樣性保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

雄性不育優(yōu)良品系的創(chuàng)新一直是科學(xué)家們的研究重點[1]。擬南芥花藥發(fā)育過程中約有3 500 個花藥特異轉(zhuǎn)錄本[2]，反映了花藥發(fā)育過程基因的多樣性及復(fù)雜的花藥發(fā)育調(diào)節(jié)過程，花藥發(fā)育調(diào)控機制的研究在雄性不育過程中十分重要，因此對花藥發(fā)育調(diào)控基因的研究具有重要的意義。

在植物花藥發(fā)育過程中，絨氈層特異表達基因(aborted microspores，AMS)是絨氈層和小孢子發(fā)育所必需，是植物花粉壁合成的關(guān)鍵因子。AMS包含1 個基本的螺旋—環(huán)—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)域，屬于bHLH 轉(zhuǎn)錄因子中的MYC 類亞家族基因[3]。MYC 蛋白已被認為是控制細胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以激活或抑制特定的靶基因表達[4]。AMS基因也具有相同的調(diào)控作用，該基因突變會導(dǎo)致過早的絨氈層退化和花粉敗育。AMS基因在不同植物的小孢子發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中存在高度相似性，目前已在擬南芥、水稻、甜瓜、辣椒、葡萄、大豆和洋蔥等植物上進行過研究。本文綜述不同植物中AMS基因功能研究進展，分析花藥發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控途徑。

1 花藥和花粉發(fā)育

在開花植物中，花藥發(fā)育是調(diào)節(jié)花藥內(nèi)特定細胞分化的復(fù)雜事件[5]，涉及多個雄蕊特異性轉(zhuǎn)錄本，是植物育種的關(guān)鍵步驟，也是成功育種和形成種子所必需的環(huán)節(jié)?；ǚ鄣男纬扇Q于花藥中2種細胞類型的分化和相互作用[6]：生殖細胞(小孢子細胞)和形成絨氈層的體細胞。小孢子被由內(nèi)到外的絨氈層、中間層、內(nèi)皮層和表皮層4 個體細胞層所包圍，從而支持小孢子發(fā)育為成熟的花粉粒[7]?；ǚ郯l(fā)育是一個復(fù)雜的過程，涉及許多事件，尤其是絨氈層發(fā)育和花粉外壁形成。絨氈層作為分泌細胞層，不僅與發(fā)育中的配子體直接接觸，且提供酶促進四分體釋放小孢子，提供蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖等養(yǎng)分促進花粉壁的形成，從而促進花粉的發(fā)育[8]。在花粉發(fā)育的后期會經(jīng)歷絨氈層細胞程序性細胞死亡(program cell death，PCD)事件[9]，依次消除細胞結(jié)構(gòu)。絨氈層細胞的分化和隨后的分解與減數(shù)分裂后的花藥發(fā)育程序非常吻合，絨氈層的過早或延遲降解與雄性不育有關(guān)[10]?；ǚ弁獗谥饕涉叻鬯匦纬?，孢粉素是一種脂族聚合物，由長鏈脂肪酸、苯基丙烷和氧化的芳香環(huán)衍生的一系列聚合物組成[11]。

花藥和花粉的發(fā)育已經(jīng)在擬南芥、水稻、黃瓜和辣椒等植物中得到廣泛的研究[12-13]，從雙子葉模式植物擬南芥到單子葉模式植物水稻2 個物種的花粉發(fā)育都涉及相似的關(guān)鍵階段。不同物種中直系同源基因的雄性不育突變體的特征進一步證明這些階段背后調(diào)控途徑的保守性。這對了解和研究其他植物中花藥發(fā)育調(diào)控途徑具有重大的意義。

2 AMS 基因與植物雄性不育

AMS屬于bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子，是植物花粉壁合成的關(guān)鍵因子，AMS突變植株會導(dǎo)致花粉形成異常，進而造成雄性不育。植物雄性育性的控制對于作物育種、雜種的產(chǎn)生以及花粉釋放的控制至關(guān)重要。目前，已在許多植物中發(fā)現(xiàn)雄性不育株，并經(jīng)過人工選育獲得不育系廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)[14-15]。但是對于花粉不育類型和雄蕊退化型性狀的保持比較困難，且不育特性受環(huán)境影響較大，不易獲得100%不育度，致使花粉不育和雄蕊退化型極少在生產(chǎn)上應(yīng)用[16]。因此加強對雄性不育調(diào)控機制的研究很有必要，以此可獲得有應(yīng)用價值的不育材料。對不同物種AMS突變體的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等的研究，可為闡明復(fù)雜的花藥發(fā)育調(diào)控途徑奠定基礎(chǔ)。

2.1 AMS 基因調(diào)節(jié)擬南芥雄性不育

AMS基因參與植物雄性不育調(diào)控的研究首先在擬南芥(Arabidopsis)中被報道[3]，研究者分離獲得敗育的小孢子(ams)突變體，對AMS突變植株進行表型鑒定及序列分析，發(fā)現(xiàn)純合突變植物完全沒有成熟的花粉，花粉敗育發(fā)生在小孢子從四分體釋放后不久、有絲分裂I 之前。AMS在擬南芥花藥的絨氈層細胞發(fā)育和減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。XU 等[17]通過微陣列分析擬南芥AMS突變植株的花藥，結(jié)果表明：ams突變體中，有549 個與絨氈層和花粉壁形成有關(guān)的花藥基因的表達發(fā)生變化，還鑒定出涉及脂質(zhì)、寡肽和離子運輸、脂肪酸合成和代謝以及黃酮醇積累等有關(guān)的13 個基因是AMS的直接靶標(biāo)。MA 等[18]同樣對AMS突變植株早期的花藥進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)有1 368 個基因在ams中差異表達，影響代謝、運輸、泛素化和脅迫反應(yīng)。對轉(zhuǎn)錄組的仔細分析并將其與遺傳和系統(tǒng)發(fā)育信息相結(jié)合，揭示了在花藥早期發(fā)育過程中建立的精細調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并擴大了對與花藥發(fā)育相關(guān)的基因?qū)哟谓Y(jié)構(gòu)的理解。AMS基因在花粉壁形成過程中有重要的調(diào)控作用，XU 等[19]用全基因組共表達分析揭示了在擬南芥ams突變體中有70 個花藥特異表達候選基因表達量降低，這其中有23 個基因是AMS 調(diào)控的靶基因。這些基因與脂肪酸延伸、酚類化合物的形成及孢粉素前體合成有關(guān)，證實豐富的花粉外殼蛋白細胞外脂肪酶(EXL5 和EXL6)以 及CYP98A8 和CYP98A9 酶是合成酚類物質(zhì)前體所需的。分析結(jié)果證明了AMS在協(xié)調(diào)孢粉蛋白生物合成和花粉壁形成中的核心作用?；蚝偷鞍字g的相互作用調(diào)節(jié)形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，ZHANG 等[20]報道了1 個功能不正常的擬南芥DYT1雄性不育突變體，該突變體表現(xiàn)出異常的花藥形態(tài)，絨氈層細胞高度液泡化，且缺乏正常的細胞質(zhì)，突變體無法完成減數(shù)分裂胞質(zhì)分裂并最終崩潰，不能形成花粉而導(dǎo)致雄性不育。DYT1 蛋白與擬南芥AMS 蛋白具有很高的相似性，可調(diào)控參與花藥絨氈層細胞的分化和發(fā)育過程，DYT1促進正確的絨氈層以發(fā)揮其正常功能，之后AMS和MS1進一步調(diào)節(jié)絨氈層細胞功能以支持正常的小孢子發(fā)育，提出DYT1位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中AMS和MS1的上游。GU 等[21]利用染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)分析明確了AMS是DYT1的下游調(diào)控基因。XIONG等[22]通過酵母雙雜交和電泳遷移率變動分析(EMSAs)證明MS 188 與AMS 形成復(fù)合物，CYP703A2(孢粉蛋白合成途徑中充當(dāng)脂肪酸羥化單加氧酶)的表達可以通過ams突變體中MS188水平的升高部分恢復(fù)，表明MS188與AMS協(xié)同激活CYP 703A2在植物絨氈層生物合成中的作用。

絨氈層發(fā)育的遺傳學(xué)研究證明存在DYT1-TDF1-AMS-MS188的分子調(diào)控通路[23]。DYT1、TDF1和AMS在絨氈層的早期發(fā)育中起作用，而MS188和MS1在絨氈層的后期發(fā)育中起作用。這些轉(zhuǎn)錄因子除激活其他轉(zhuǎn)錄因子的表達外，還調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，AMS可能調(diào)節(jié)參與花粉壁形成的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白和E3 泛素連接酶，從而降解先前過程中產(chǎn)生的蛋白。FERGUSON 等[24]研究表明：AMS在早期和晚期花粉發(fā)育過程中均表現(xiàn)出復(fù)雜的調(diào)控表達并具有迄今未表征的雙重作用；進一步研究絨氈層功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，表明反饋回路和調(diào)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)對于控制花藥絨氈層中瞬時基因表達以產(chǎn)生可育的花粉至關(guān)重要。

2.2 AMS 同源基因TDR 調(diào)節(jié)水稻雄性不育

水稻(Oryza sativa)是人類的糧食作物，可養(yǎng)活近一半的全球人口，而且還是促進植物科學(xué)研究的理想單子葉植物模型。目前水稻中已經(jīng)報道參與小孢子發(fā)育的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子包括UDT1(OsbHLH164)、EAT1/DTD (OsbHLH141)、bHLH142/TIP2 (OsbHLH142)和TDR1 (OsbHLH5)等，他們大部分在絨氈層細胞程序性死亡和花粉形成過程中起關(guān)鍵作用，其突變植株會導(dǎo)致花粉形成異常，進而引起雄性不育[25]。這些轉(zhuǎn)錄因子的功能異常所引起的細胞雄性不育在細胞水平上具有一定的相似性。

TDR與擬南芥中的AMS是直系同源基因，LI 等[26]首次報道了水稻雄性不育突變體tdr的分離和表征，發(fā)現(xiàn)該TDR基因優(yōu)先在絨氈層中表達，并編碼1 個假定的基本螺旋—環(huán)—螺旋蛋白。通過染色質(zhì)免疫沉淀分析和電泳遷移率變動分析，得出編碼Cys 蛋白酶和蛋白酶抑制劑的OsCP1和Osc6可能是TDR的直接靶標(biāo)，后續(xù)研究表明OsC6 蛋白是TDR的直接靶標(biāo)[27]。水稻tdr突變體花粉壁的形成發(fā)生明顯的改變[28]，花藥中的脂肪酸、伯醇、烷烴和鏈烯烴等含量異常增加。TDR除具有促進絨氈層PCD的功能外，還可能在水稻花粉發(fā)育過程中的幾個基本生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。GAMYB和UDT1在早期階段可并行調(diào)節(jié)花藥發(fā)育，并可能積極激活TDR的表達[29]。TDR和EAT1相互作用，直接調(diào)節(jié)編碼天冬氨酸蛋白酶的OsAP25和OsAP37的表達[30]，對水稻花藥發(fā)育過程的細胞程序性死亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有利的研究工具。F-box 蛋白Os-ADF 作為TDR的直接靶標(biāo)之一，在水稻絨氈層細胞的發(fā)育和花粉形成中起著至關(guān)重要的作用[31]。水稻基本螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)蛋白TDR 相互作用蛋白2 (TIP2)在早期花藥發(fā)育過程中，作為分生組織過渡和分化的關(guān)鍵開關(guān)，是細胞程序性死亡的主要調(diào)控因子[32-33]。TIP2是與TDR相互作用的另一種bHLH，作用于UDT1的下游，但在TDR和EAT1的上游，而TIP2可以與TDR形成二聚體以通過與其啟動子結(jié)合來進一步激活EAT1轉(zhuǎn)錄。最新的研究[34]結(jié)果表明：TIP3在調(diào)控花粉外壁形成中發(fā)揮著重要的作用，TIP3或TIP3與TDR的相互作用可能直接或間接激活特定的下游基因來調(diào)節(jié)水稻的絨氈層降解和花粉壁形成，為雜交水稻雄性不育的研究提供新的育種思路。

2.3 AMS 基因調(diào)節(jié)甜瓜雄性不育

甜瓜(Cucumis meloL.)是全世界廣泛種植的葫蘆科經(jīng)濟作物之一，相對于其他的園藝作物，瓜類表現(xiàn)出很大的雜種優(yōu)勢[35]。在水稻[36]、番茄[37]和辣椒[38]等作物上多個核隱性遺傳雄性不育基因已經(jīng)被精確定位，且生產(chǎn)上已有雄性不育突變體的利用，但關(guān)于甜瓜雄性不育的報道很少。

甜瓜雄性不育突變體ms5最早由美國Clause種子公司在抗白粉病品種PMR45 育種過程中發(fā)現(xiàn)，并應(yīng)用于雜交一代制種中[39]。甜瓜雄性不育(ms5)突變體候選基因AMS的定位和初步分析結(jié)果表明：AMS是其雄性不育的可能候選基因[40]。為探索甜瓜細胞核雄性不育系ms5花藥敗育發(fā)生的時期及不同時期雄花物質(zhì)含量與雄性不育之間的關(guān)系，有學(xué)者研究了不育株ms5的花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)，且發(fā)現(xiàn)不育株可溶性糖、蛋白質(zhì)及游離脯氨酸含量均在花藥發(fā)育四分體時期出現(xiàn)明顯變化[41]。曾雙等[42]針對如何篩選出甜瓜AMS基因進行了研究，結(jié)果表明：AMS基因啟動子在光、逆境、激素和化合物質(zhì)等相關(guān)方面都有其作用元件，并利用酵母單雜交篩選到與AMS基因啟動子順式作用元件高度結(jié)合從而編碼甜瓜雄性不育基因表達的LOC103496635 蛋白。但關(guān)于AMS轉(zhuǎn)錄因子是如何調(diào)控甜瓜雄性不育的過程仍不是很清楚。

2.4 AMS 基因調(diào)節(jié)辣椒雄性不育

辣椒(Capsicum annuumL.)是一種重要的園藝作物。雄性不育品系的使用可實現(xiàn)高效的商業(yè)雜交辣椒種子生產(chǎn)。盡管雄性不育系已廣泛用于辣椒育種[38]，但對花粉敗育的機理知之甚少。

通過辣椒花藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析[43]，結(jié)合VIGS 基因沉默技術(shù)，篩選得到導(dǎo)致部分植株花粉敗育的辣椒育性相關(guān)基因CaAMS，該基因存在2種剪接體，CaAMS-1在單核早中期表達量最高，而CaAMS-2的最高表達量則出現(xiàn)在四分體時期。從辣椒花芽中分離并鑒定擬南芥AMS同源轉(zhuǎn)錄因子CaAMS，使用VIGS 評估CaAMS的功能[44]，發(fā)現(xiàn)在CaAMS基因沉默的花藥中，LAP5、MS1、DRL1、ABCG26和CYP703A的表達水平大大降低，辣椒花絲縮短，雄蕊干枯，花粉敗育，與擬南芥中ams突變體的表型類似。在CaAMS突變植株中，一些涉及花粉外壁合成的基因被下調(diào)，且CaAMS優(yōu)先在四倍體和單核階段的絨氈層中表達，表明CaAMS可通過調(diào)節(jié)復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)在辣椒絨氈層和花粉發(fā)育中起重要作用。

2.5 其他植物AMS 基因克隆與功能研究進展

除上述幾種植物外，在其他植物中也有關(guān)于AMS基因的報道。對葡萄花藥發(fā)育相關(guān)基因表達進行分析[45]，獲得在花蕾不同發(fā)育時期表達差異顯著的VvAMS基因，對葡萄VvAMS進行初步的序列分析，發(fā)現(xiàn)VvAMS基因編碼的蛋白含有bHLH.MYC-N 端結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH 轉(zhuǎn)錄因子MYC 亞家族。但是葡萄花粉敗育并不是由AMS基因突變直接引起，推測AMS基因的表達可能影響下游MS2基因的表達，從而導(dǎo)致花粉敗育。而關(guān)于葡萄中AMS基因的調(diào)控機制還有待進一步的研究。袁巧玲[46]初步探討了AcAMS與洋蔥細胞質(zhì)雄性不育的關(guān)系，洋蔥遺傳體系尚未建立完善，利用VIGS 技術(shù)獲得部分不育與完全不育的轉(zhuǎn)基因植株，洋蔥AcAMS可能與細胞雄性不育有關(guān)。洋蔥細胞質(zhì)雄性不育系SA2 及其保持系SB2 中，AcAMS主要在洋蔥的花藥中表達，且在花粉母細胞時期和四分體時期表達差異顯著，推測由此導(dǎo)致SA2的不育。AcAMS基因與其他同源性較高的物種AMS序列分析表明：它們存在bHLH 結(jié)構(gòu)域，同源性均大于50%，表明AMS基因在物種進化上的高度保守性。金玲等[47]克隆大豆GmAMS基因，通過GUS 融合表達分析GmAMS的時空表達，表明其主要在花藥早期表達，并發(fā)現(xiàn)5 個參與花藥發(fā)育的重要互助蛋白基因(GLYMA12G18960、GLYMA20G29600、GLYMA13G32360、GLYMA10G38255和GLYMA08-G44950)。GmAMS的異常表達影響其他花發(fā)育關(guān)鍵基因的表達，繼而影響大豆花粉的正常發(fā)育。

3 展望

目前在不同植物中鑒定出的AMS具有高度的保守性，其在植物花藥發(fā)育調(diào)控上起著至關(guān)重要的作用，與植物花粉敗育密切相關(guān)。絨氈層發(fā)育和小孢子母細胞的發(fā)育是花藥發(fā)育過程至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，盡管絨氈層發(fā)育的確切機制仍然有待闡明，但已經(jīng)鑒定出與絨氈層形成、發(fā)育和程序性細胞死亡(PCD)有關(guān)的幾種基因，綜合以上AMS基因的相關(guān)報道可知：AMS突變體的絨氈層細胞和中層細胞在小孢子母細胞減數(shù)分裂時擴張，進而阻止正常的細胞程序性死亡(PCD)，影響小孢子母細胞發(fā)育過程，花粉外壁不能正常發(fā)育，花粉形成異常，最終導(dǎo)致植株的雄性不育。目前在擬南芥和水稻上的研究比較深入，兩者具有很高的相似性，已有基本的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，擬南芥：DYT1-TDF1-AMS-MYB80-MS1[23]，水 稻：DsMADS3-MSP1-UDT1-TDR-EAT1-OsAP25/37[48]。系統(tǒng)發(fā)育分析支持擬南芥DYT1和水稻UDT1基因?qū)儆谕环种?，均在減數(shù)分裂和絨氈層程序死亡中擔(dān)任關(guān)鍵的角色[20]。因此，水稻UDT1-TDR基因和擬南芥DYT1-AMS基因很可能代表對正?；ㄋ幇l(fā)育至關(guān)重要的進化保守調(diào)控通路。而對甜瓜和辣椒的研究較淺，AMS可能只間接調(diào)節(jié)甜瓜雄性不育，目前未有深入研究，應(yīng)進一步研究以確定AMS轉(zhuǎn)錄因子的遺傳功能。辣椒的研究結(jié)果表明：CaAMS通過調(diào)節(jié)復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)在辣椒絨氈層和花粉發(fā)育中起重要作用，這更進一步明確了AMS基因在不同物種中的相似調(diào)控。在洋蔥、大豆和葡萄上都進行了AMS基因的克隆及同源序列分析，初步得出AMS與花粉敗育有關(guān)，但其具體的分子機制仍需進一步研究。本文綜述了AMS基因在不同植物花藥發(fā)育過程的調(diào)控作用，期望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來創(chuàng)制和篩選突變體，進一步解析AMS在整個花藥發(fā)育過程中的分子機制，為植物雄性不育新種質(zhì)的選育提供理論指導(dǎo)。