基于SWChen 系統(tǒng)預(yù)測(cè)靶向林麝(Moschus berezovskii) FASN、HMGCR 和CYP11A1基因miRNAs的研究*

諶穎蓮，曾德軍，趙貴軍，封孝蘭，張承露，吳佳勇，竭 航

(重慶市藥物種植研究所，特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 408435)

麝香是一種珍貴的動(dòng)物源藥材，具有較高的藥用價(jià)值和香料價(jià)值[1-4]，但其形成過(guò)程復(fù)雜且未知，限制了麝香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和產(chǎn)香效率的提高。研究表明：麝香的化學(xué)組分包括脂肪酸類的烷烴物質(zhì)或衍生的醇類、酮類和醛類 (如麝香酮、6-甲基庚烷-1,6-二醇和十六烯醛等)以及固醇類、甾類和芳香族類物質(zhì) (如膽固醇、間甲酚和二氫雌甾酮等)[2]，這些化學(xué)組分對(duì)麝香形成至關(guān)重要，同時(shí)也是麝香藥用和香用價(jià)值的關(guān)鍵物質(zhì)。動(dòng)物的脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)、3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)和細(xì)胞色素P450 家族11 亞家族A1 (CYP11A1)是長(zhǎng)鏈的脂肪酸類衍生物、大環(huán)碳鏈酮類以及芳香族甾類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶[5-9]?；邝晗愕幕瘜W(xué)組分和合成相關(guān)化學(xué)組成的關(guān)鍵酶，在林麝(Moschus berezovskii)中篩選調(diào)控FASN、HMGCR和CYP-11A1基因表達(dá)的調(diào)控因子，對(duì)探究麝香可能的生物合成機(jī)制具有重要意義。

MicroRNA (miRNA)是一種長(zhǎng)度約為20 nt的非編碼RNA，通過(guò)作用靶基因mRNA的3′-UTR 在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和代謝等過(guò)程具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[10-11]。篩選調(diào)控林麝FASN、HMGCR和CYP11A1基因表達(dá)的miRNAs 能夠進(jìn)一步了解麝香的生物合成過(guò)程，然而現(xiàn)在已知的林麝基因序列信息非常少，缺少林麝基因的mRNA 和miRNA 序列信息[1,12]。由于牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)和綿羊(Ovis aries)與林麝編碼基因的3′-UTR 序列并不完全一致，通過(guò)同源物種來(lái)推測(cè)調(diào)控林麝基因的miRNAs 獲取信息并不完整，缺少適合預(yù)測(cè)林麝miRNAs的工具。本研究通過(guò)基于Smith-Waterman 局部序列比對(duì)算法[13]編寫的SWChen系統(tǒng)對(duì)調(diào)控林麝FASN、HMGCR和CYP11A1基因表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行預(yù)測(cè)篩選，并以人(Homo sapiens)的FASN基因?yàn)槔?，與TargetScan、mi-RDB 和miRSytem 預(yù)測(cè)軟件和miRTarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)比較，評(píng)價(jià)SWChen 系統(tǒng)對(duì)miRNAs 預(yù)測(cè)能力；利用代謝組學(xué)測(cè)序來(lái)確定麝香的化學(xué)成分，對(duì)與合成相關(guān)化學(xué)成分有關(guān)的FASN、HMGCR和CYP11A1基因進(jìn)行miRNAs 預(yù)測(cè)，以林麝、牛、山羊和綿羊預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行集合論分析確定候選miRNAs，以期為麝香的生物合成機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

118 頭健康成年雄性林麝 (5 歲) 飼養(yǎng)于重慶市藥物種植研究所林麝養(yǎng)殖基地(N29°，E107°，海拔678 m)，飼養(yǎng)采用精飼料和青綠飼料[紅薯藤 (Ipomoea batatas)和光葉海桐 (Pittosporum glabratum)嫩葉]相結(jié)合的方式，自由采食。精飼料包括 65%玉米、25%大豆、6%麥麩、0.4%食鹽、1.5% CaCO3、0.8% CaHPO4、0.15%維生素和0.15%礦物質(zhì)。每天17：30 混合精飼料與紅薯藤等補(bǔ)充飼喂。

1.2 樣品采集

在5—6 月泌香盛期，采用微創(chuàng)香腺采集法獲取林麝香腺組織樣本，立刻放入RNA 保存液中并轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存；在11—12 月麝香成熟階段，通過(guò)“活麝取香”法采取林麝成熟麝香3 份，置于離心管內(nèi)保存。

1.3 代謝組檢測(cè)

將采集到的麝香樣品送至上海百趣生物有限公司采用GC-MS 進(jìn)行非靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測(cè)，使用甲醇—氯仿(體積比為3∶1)溶液進(jìn)行萃取，通過(guò)總離子流圖信號(hào)獲取麝香的主要化學(xué)成分及相對(duì)含量。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)定及序列分析

通過(guò)總RNA 提取后，送樣至上海生工生物科技有限公司采用Hi-seq 2500 測(cè)序。然后將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行Trinity 拼接、序列比對(duì)和功能注釋等獲得FASN、HMGCR和CYP11A1基因mRNA 序列并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，確定3′-UTR 序列以及林麝miRNAs 序列數(shù)據(jù)；以牛、山羊和綿羊?yàn)閰⒖迹瑢?duì)3 個(gè)基因的3′-UTR 序列進(jìn)行比對(duì)，并使用MEGA 6.0 及最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)；通過(guò)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(unafold.rna.albany.edu)了解各物種基因3′-UTR 序列的差異情況。

1.5 SWChen 系統(tǒng)對(duì)miRNAs 預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

由于目前常用的miRNAs 預(yù)測(cè)軟件如miRSystem (mirsystem.cgm.ntu.edu)、TargetScan (www.targetscan.org)和miRDB (mirdb.org)僅預(yù)測(cè)部分常見(jiàn)物種的miRNAs，無(wú)法對(duì)調(diào)控林麝基因的miRNA 進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，因此，本研究在miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)(www.mirbase.org)下載人的miRNAs序列，并在GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查詢?nèi)薋ASN基因3′-UTR 序列(NM_0041 04.5)，利用SWChen系統(tǒng) (https://github.com/YLCHEN1992/SWChen)對(duì)調(diào)控FASN表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)與在線軟件miRSystem、TargetScan 和miRDB的預(yù)測(cè)結(jié)果比較，以miRTarbase 數(shù)據(jù)庫(kù)(mirtarbase.cuhk.edu.cn)中調(diào)控FASN表達(dá)的全部miRNAs (miRTarget_All)和具有強(qiáng)力證據(jù)可調(diào)控人FASN基因表達(dá)的miRNAs(miRTarget_High)作為參考，檢測(cè)SWChen 系統(tǒng)對(duì)miRNA 預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.6 調(diào)控FASN、HMGCR 和CYP11A1 基因表達(dá)的miRNA 預(yù)測(cè)

將得到的林麝mRNA 3′-UTR 序列及獲得的林麝miRNAs 數(shù)據(jù)庫(kù)利用SWChen 系統(tǒng)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)調(diào)控林麝FASN、HMGCR和CYP11A1基因表達(dá)的miRNAs；在GenBank 中獲取牛、山羊和綿羊FASN、HMGCR和CYP11A1基因的mRNA序列(表1)。在miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取牛、山羊和綿羊的miRNA 序列，由于綿羊miRNA 數(shù)量較少，將山羊和綿羊miRNA 進(jìn)行整合得到羊的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，共同用于山羊和綿羊miRNA的預(yù)測(cè)分析。利用SWChen 系統(tǒng)預(yù)測(cè)調(diào)控牛、山羊和綿羊FASN、HMGCR和CYP11A1基因的候選miRNAs，并通過(guò)雙閾值(種子序列匹配評(píng)分及親和程度評(píng)分同時(shí)考慮)預(yù)測(cè)調(diào)控基因表達(dá)的miRNAs，以增加預(yù)測(cè)精度，最后將預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行集合論分析以期獲取麝香合成相關(guān)和候選miRNAs 分子。

表1 物種基因序列GenBank 編號(hào)Tab.1 GenBank No.of species gene sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 SWChen 系統(tǒng)miRNA 功能預(yù)測(cè)結(jié)果

由圖1 可知：SWChen 通過(guò)種子區(qū)匹配預(yù)測(cè)(single)調(diào)控人FASN的基因共有193 條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)8 條，匹配miRTarget_High數(shù)據(jù)3 條，而調(diào)高miRNA 與mRNA 親和力判定閾值后(雙閾值)與miRTarbase 數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配；TargetScan 在線軟件預(yù)測(cè)有745 條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)15 條，匹配miRTarget_High數(shù)據(jù)3 條；miRSystem 在線軟件預(yù)測(cè)有62 條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)4 條，匹配miRTarget_High 數(shù)據(jù)4 條；miRDB 在線軟件預(yù)測(cè)有47條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)6 條，匹配miRTarget_High 數(shù)據(jù)2 條。4 個(gè)軟件預(yù)測(cè)的miRNAs結(jié)果集合統(tǒng)計(jì)(圖2)顯示：TargetScan 出現(xiàn)530條獨(dú)立miRNAs，miRSystem 和miRDB 分別出現(xiàn)10 條和1 條獨(dú)立的miRNAs；SWChen 系統(tǒng)總共出現(xiàn)3 條獨(dú)立的miRNAs，有186 條與Target-Scan 結(jié)果重疊，31 條與miRSystem 結(jié)果重疊，39 條與miRDB 結(jié)果重疊，雙閾值SWChen 結(jié)果除miRSystem 均包含在其他軟件預(yù)測(cè)結(jié)果中。

圖1 4種miRNA 預(yù)測(cè)軟件與miRTarget 數(shù)據(jù)庫(kù)匹配情況Fig.1 Comparing prediction results of four miRNA prediction softwares by using miRTarget database match

圖2 4種miRNA 預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果集合統(tǒng)計(jì)Fig.2 The gather statistic to resuls of four miRNA prediction softwares

2.2 林麝成熟麝香代謝組測(cè)序分析結(jié)果

林麝麝香化學(xué)組分含量最高的前10 個(gè)物質(zhì)列于表2。結(jié)果顯示：成熟麝香中的主要成分為長(zhǎng)碳鏈的酮和醛等物質(zhì)、特殊脂肪酸碳鏈的環(huán)酮類物質(zhì)以及芳香族和甾類物質(zhì)。

表2 成熟麝香主要化學(xué)組分Tab.2 The main chemical components of matured musk

2.3 物種基因序列進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由圖3 可知：同一基因之間3′-UTR 序列存在差異較小，其中林麝FASN和HMGCR基因3′-UTR 序列與牛和羊被分為兩類，而林麝CYP11A1基因3′-UTR 序列與山羊和綿羊被歸為一類。進(jìn)一步對(duì)各基因的3′-UTR 序列進(jìn)行RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖4)顯示：林麝、牛、山羊和綿羊FASN基因3′-UTR 序列RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為-222.80、-234.60、-229.10 和-234.70 kcal/mol，HMGCR基因3 ′-UTR序列RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為-466.00、-477.60、-267.20 和-1 417.30 kcal/mol，CYP11A1基因3′-UTR 序列RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為-110.10、-112.90、-105.50 和-112.00 kcal/mol，其中林麝和牛FASN基因3′-UTR 與山羊和綿羊相比出現(xiàn)較多的單鏈空泡。

圖3 基因3′-UTR 序列進(jìn)化樹(shù)比對(duì)Fig.3 Sequence alignment of gene 3′-UTR by evolution tree construction

圖4 各物種基因3′-UTR RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted RNA secondary structures of gene 3′-UTR sequences in respective species

2.4 SWChen 系統(tǒng)分析各物種調(diào)控FASN、HMGCR和CYP11A1 基因表達(dá)的miRNAs

通過(guò)miRNA 轉(zhuǎn)錄組序列保守分析發(fā)現(xiàn)：林麝miRNAs 數(shù)據(jù)總有1 391 條，miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢牛的miRNAs 數(shù)據(jù)為1 030 條，山羊和綿羊的數(shù)據(jù)為519 條。SWChen 系統(tǒng)的種子匹配預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：調(diào)控林麝、牛、山羊和綿羊FASN基因表達(dá)的miRNAs 在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)中的占比分別為5.25%、5.53%、1.70%和2.38%；調(diào)控HMGCR基因表達(dá)的miRNAs 占比分別為12.55%、13.11%、10.88%和6.12%；調(diào)控CYP11A1基因表達(dá)的mi-RNAs 占比分別為3.54%、3.69%、4.76%和4.22%；在林麝和牛中，調(diào)控FASN和HMGCR基因表達(dá)的miRNAs 占比高于山羊和綿羊，而調(diào)控CYP11A1基因表達(dá)的miRNAs 占比低于山羊和綿羊。集合論分析結(jié)果(圖5 和表3)顯示：在4 個(gè)物種中，調(diào)控FASN基因表達(dá)的miRNAs 交集為miR-24-3p 和miR-30b-3p；調(diào)控HMGCR基因表達(dá)的mi-RNAs 交集為miR-29b、miR-146a 和miR-2284d；調(diào)控CYP11A1基因表達(dá)的miRNAs 交集為let-7家族。

表3 調(diào)控基因的miRNA 交集Tab.3 miRNA intersection of targeting genes

圖5 4 個(gè)物種中調(diào)控FASN、HMGCR 和CYP11A1 基因表達(dá)的miRNAs 集合分析維恩圖Fig.5 Venn diagram of miRNAs regulating FASN, HMGCR and CYP11A1 genes expression intersection analysis in four species

雙閾值分析結(jié)果顯示(表4)：調(diào)控FASN基因表達(dá)的miRNAs 僅在山羊和綿羊中存在miR-874-5p 交集；調(diào)控HMGCR基因表達(dá)的miRNAs在林麝、牛和山羊中存在miR-545-3p、miR-429和miR-181b-3p 交集，調(diào)控CYP11A1基因表達(dá)的miRNAs 僅在林麝、山羊和綿羊中存在miR-532-3p的交集。

表4 在各物種中預(yù)測(cè)調(diào)控基因的miRNAs (雙閾值)Tab.4 Predicted miRNAs targeting genes in species respectively (dual thresholds)

3 討論

SWChen 系統(tǒng)是基于Smith-Waterman 局部序列比對(duì)算法和堿基互補(bǔ)配對(duì)原理[11,13]，預(yù)測(cè)2 條序列之間的相互作用能力和相似性情況的程序，主要基于R 語(yǔ)言軟件編寫，用于RNA 之間的作用情況預(yù)測(cè)[14-17]。計(jì)分規(guī)則參數(shù)使得序列比對(duì)過(guò)程中出現(xiàn)連續(xù)3～4 個(gè)的相互匹配才能抵消1 個(gè)錯(cuò)配，符合miRNA 序列種子匹配規(guī)則，通過(guò)矩陣最大值進(jìn)行重新回?cái)?shù)算分即為SWChen 系統(tǒng)的最終評(píng)分，選擇適合的評(píng)分參數(shù)對(duì)于提高相互作用預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性具有重要意義。

Smith-Waterman 算法是評(píng)價(jià)2 條序列之間功能域和保守域的比對(duì)算法，相比BLAST 算法[18]和馬爾可夫模型[19]推算，Smith-Waterman 算法更加準(zhǔn)確，能夠滿足預(yù)測(cè)需求，但是這種算法的速度最慢，且會(huì)忽略第2 評(píng)分結(jié)合位置。miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)包含了現(xiàn)有已驗(yàn)證調(diào)控功能的miRNAs，而在所有物種的研究中，人FASN研究證據(jù)較多，因此以人種為對(duì)象評(píng)估SWChen 系統(tǒng)的準(zhǔn)確性具有更高的可信度。程序評(píng)估結(jié)果顯示：4種預(yù)測(cè)工具的結(jié)果差異并不大，其中SWChen 相比miRSystem 和miRDB 工具能預(yù)測(cè)出較多的候選miRNAs，匹配miRTarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNAs條數(shù)更多；而TargetScan 預(yù)測(cè)的miRNAs 條數(shù)約為SWChen的4 倍，但匹配數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNAs 約為SWChen的2 倍，提示SWChen的背景噪音相對(duì)TargetScan 較小。所有的miRNA 預(yù)測(cè)工具均基于miRNA 對(duì)靶基因的識(shí)別機(jī)制[11]，其中TargetScan 在計(jì)分過(guò)程中考慮結(jié)合位置的保守性和miRNA 親和程度，再去除物種序列保守性判斷之后預(yù)測(cè)的miRNAs 會(huì)增加，而SWChen 并不考慮序列保守性，同時(shí)將評(píng)分控制為80 分，即種子區(qū)域的完全匹配，占據(jù)識(shí)別機(jī)制中的大部分識(shí)別情況；而TargetScan的算法包括了miRNA 第2～8 位和第3～8 位的匹配規(guī)律[11]，因此預(yù)測(cè)出較多的候選miRNAs，但卻增加了錯(cuò)誤miRNAs的噪音，這是TargetScan 和SWChen 之間預(yù)測(cè)結(jié)果差異的原因。miRSystem 系統(tǒng)為集成多種預(yù)測(cè)工具的miRNA 預(yù)測(cè)系統(tǒng)，在預(yù)測(cè)結(jié)果中獲得強(qiáng)有力證據(jù)的miRNAs 匹配條數(shù)最多，背景噪音相對(duì)較小，但匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)的數(shù)量也減少，在miRNA的靶基因研究中，miRNA 預(yù)測(cè)主要基于多工具的交集篩選，因此集成的miRSystem 會(huì)得到更多的miRTarget_High 匹配結(jié)果；雙閾值預(yù)測(cè)能夠得到較多的重疊miRNAs，暗示雙閾值的準(zhǔn)確性可能更高。SWChen 系統(tǒng)能夠滿足miRNA 靶基因預(yù)測(cè)的需求，能夠得到相對(duì)其他工具同等價(jià)值的結(jié)果，且離線預(yù)測(cè)、數(shù)據(jù)庫(kù)及參數(shù)的可變動(dòng)使其更加靈活，能夠預(yù)測(cè)林麝miRNAs 對(duì)靶基因的調(diào)控情況，可為特種動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物和真菌等關(guān)鍵miRNA的篩選提供便利。

已有研究表明：麝香的形成過(guò)程主要有2種假設(shè)[1-4,12]。第一，林麝香腺分泌初香后，初香物質(zhì)儲(chǔ)存于香囊中經(jīng)微生物的發(fā)酵熟化后形成成熟麝香；第二，林麝香腺直接分泌麝香的主要化學(xué)成分儲(chǔ)存于香囊中積累，而微生物不是麝香形成的決定因素。無(wú)論林麝通過(guò)哪種方式形成成熟麝香，林麝合成和分泌的化學(xué)組分對(duì)麝香的形成至關(guān)重要。通過(guò)代謝組學(xué)的手段對(duì)麝香進(jìn)行檢測(cè)，使用不同的萃取試劑得到的化學(xué)組分和含量有一定差異，在麝香的甲醇和氯仿提取物中主要成分為脂肪酸類的烷烴類、醇類、酮類、醛類、固醇類、甾類及芳香族類物質(zhì)，與其他文獻(xiàn)報(bào)道[2]一致。脂肪酸衍生類、環(huán)酮類、甾類和固醇類為麝香的主要成分，而FASN、HMGCR和CYP11A1是合成上述物質(zhì)的關(guān)鍵基因。

FASN基因?qū)τ陂L(zhǎng)鏈脂肪酸的合成和活化過(guò)程具有重要作用[5,9,20-22]，如碳鏈的延伸、末端?；幕罨碗p鍵的還原等，特別是與麝香酮(3-甲基環(huán)十五酮)碳鏈骨架的形成具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性；同時(shí)FASN 合成的亞基酶對(duì)碳鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)、去飽和、脫羥基和碳鏈活化等具有重要作用，如?；d體蛋白β-酮酰ACP 還原酶和β-酮酰ACP水解酶等。對(duì)于固醇類和甾類物質(zhì)而言，HMGCR是其合成的限速酶[8-9]，它參與甲羥戊酸的合成，而甲羥戊酸作為基礎(chǔ)物質(zhì)進(jìn)一步形成異戊烯基焦磷酸、鯊烯、羊毛固醇和膽固醇等產(chǎn)物，對(duì)于類固醇物質(zhì)的合成和分泌具有重要作用。CYP11A1是膽固醇的側(cè)鏈裂解的關(guān)鍵酶[4,8,23]，對(duì)于孕烯酮、雄烯二酮和脫氫雄甾酮等物質(zhì)合成至關(guān)重要，而在麝香檢測(cè)到大量的雄性激素前體物質(zhì)，如反式-脫氫雄甾酮，其合成同時(shí)需要HMGCR和CYP11A1的參與。因此，F(xiàn)ASN、HMGCR和CYP11A1對(duì)于麝香的生物合成有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，具有較大的研究?jī)r(jià)值和潛力。miRNAs 是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子[10-11]，對(duì)生物代謝組分的調(diào)控具有關(guān)鍵作用。1 個(gè)基因可受多條miRNAs調(diào)控，同時(shí)1 條miRNAs 可調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，預(yù)測(cè)共同靶向林麝多個(gè)麝香合成相關(guān)基因表達(dá)的miRNAs 對(duì)探究麝香生物合成機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也為牛和羊的肉質(zhì)和繁殖性狀相關(guān)研究提供參考。

林麝、牛、山羊和綿羊的FASN、HMGCR和CYP11A1基因3′-UTR 序列差異較小，同源物種之間基因的3′-UTR 有保守性，保守區(qū)域可能為共同的miRNAs 作用位點(diǎn)，同時(shí)也驗(yàn)證了序列拼接的正確性[12]；較高的自由能及更多的單鏈空泡結(jié)構(gòu)將增加miRNA 與mRNA的結(jié)合概率[14-15]。通過(guò)SWChen 系統(tǒng)分別對(duì)4 個(gè)物種中調(diào)控FASN、HMGCR和CYP11A1基因的miRNAs 進(jìn)行預(yù)測(cè)，在林麝和牛中，F(xiàn)ASN基因受控的miRNAs 在各自miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的占比相對(duì)山羊和綿羊較高，暗示林麝和牛FASN基因受miRNA 調(diào)控的潛力強(qiáng)于山羊和綿羊，與RNA 結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果一致；林麝HMGCR基因受miRNA 調(diào)控的數(shù)量占比較高，可能與其3′-UTR 長(zhǎng)度和序列復(fù)雜程度有關(guān)；而CYP11A1基因在4 個(gè)物種之間預(yù)測(cè)的候選miRNA 數(shù)量差異不大，且RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)空泡結(jié)構(gòu)及最小自由能差距不明顯，暗示4 個(gè)物種CYP11A1基因受miRNA 調(diào)控的潛力一致。候選miRNAs 數(shù)量在相應(yīng)物種總體數(shù)據(jù)庫(kù)中的占比和基因3′-UTR的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和最小自由能預(yù)測(cè)，可為分析miRNA 對(duì)基因的調(diào)控潛能提供參考。

集合論分析顯示：4 個(gè)物種FASN基因共同受到miR-24-3p 和miR-30b-3p 調(diào)控，miR-24-3p 可通過(guò)調(diào)控鋅指同源基因ZHX2(zinc fingers and homeoboxes 2)影響FASN基因的表達(dá)[24]，miR-30c-5p 可調(diào)控下調(diào)FASN的表達(dá)改善肝性脂肪沉積[22]，預(yù)測(cè)miR-24-3p 和miR-30b-3p 有很大的潛力調(diào)控4 個(gè)物種的FASN基因表達(dá)。預(yù)測(cè)調(diào)控HMGCR基因表達(dá)的miRNAs 結(jié)果顯示：miR-29b、miR-146a 和miR-2284d 為4 個(gè)物種miRNA的交集部分，miR-29 能夠抑制小鼠HMGCR的表達(dá)而影響在肝臟的膽固醇沉積[25]，miR-29b 作為miR-29的同源miRNAs，具有較大的潛力調(diào)控4 個(gè)物種HMGCR的表達(dá)，miR-146a 與免疫炎癥、心血管疾病、糖尿病及總膽固醇含量等具有一定的相關(guān)性[26-29]，這些因素均與固醇類和甾類物質(zhì)合成相關(guān)，miR-146a 存在很大的潛能調(diào)控HMGCR基因的表達(dá)影響固醇類物質(zhì)的合成導(dǎo)致相應(yīng)疾病發(fā)生；通過(guò)雙閾值分析可知：調(diào)控HMGCR基因表達(dá)的miRNA 有較大可能為miR-181b-3p 和miR-429 家族，miR-181d-5p 能夠顯著下調(diào)豬的HMGCR基因[30]，而雞肝臟中的miR-429 與HMGCR的表達(dá)具有較強(qiáng)的相關(guān)性[31]，因此 miR-29b、miR-146a、miR-181b-3p 和 miR-429 都具有調(diào)控HMGCR表達(dá)的潛力。調(diào)控CYP11A1基因表達(dá)的miRNAs 集合分析顯示均屬于let-7 家族成員，let-7 家族是細(xì)胞中含量最為豐富的miRNA 家族，參與動(dòng)物免疫、繁殖和生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程[32-34]；CYP11A1屬于雄性激素的合成限速酶[8-9]，在各物種中均有較高的保守性。結(jié)合UTR 進(jìn)化樹(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和miRNA 占比可知：4 個(gè)物種CYP11A1基因的相關(guān)參數(shù)基本接近一致，暗示let-7 對(duì)保守性較強(qiáng)的CYP11A1有較強(qiáng)的調(diào)控潛能；進(jìn)一步的雙閾值預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：miR-532-3p 也能夠調(diào)控CYP11A1基因的表達(dá)，而miR-532-3p 被報(bào)道涉及女性不孕不育[35]，miR-532-3p 可能通過(guò)調(diào)控CYP11A1基因?qū)е孪嚓P(guān)生殖類疾病。而在林麝中未發(fā)現(xiàn)共同調(diào)控FASN、HMRCR和CYP11A1的miRNAs 分子，但miR-205 和miR-143 家族存在交集，有參與麝香合成調(diào)控通路的可能。研究表明：miR-205主要參與AKT 和Wnt 信號(hào)通路[36-40]，miR-143主要參與NF-kappaB 信號(hào)通路[41-43]，暗示麝香的生物合成機(jī)可能涉及miR-205 和miR-143 參與的AKT、Wnt 和NF-kappaB 信號(hào)通路。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)自主開(kāi)發(fā)的SWChen 系統(tǒng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：調(diào)控林麝FASN基因表達(dá)的miRNA 包括miR-24-3p 和miR-30b-3p，調(diào)控林麝HMGCR基因表達(dá)的miRNA 有miR-29b、miR-146a、miR-181b-3p 和miR-429 家族，調(diào)控林麝CYP11A1基因表達(dá)的miRNA 有miR-532-3p 和let-7 家族，共同調(diào)控林麝3 個(gè)基因表達(dá)的miRNAs 主要為miR-205 家族和miR-143 家族。研究結(jié)果可為研究林麝、牛、山羊和綿羊FASN、HMGCR和CYP11A1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供參考，同時(shí)對(duì)解析林麝的麝香合成機(jī)制具有重要意義。