自然貯藏對(duì)‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子萌發(fā)及抗氧化酶活性的影響*

蔣金娟，王 琰，朱德榮，徐 翠，王鴻發(fā)，羅富成

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.普洱市思茅區(qū)畜牧工作站，云南 普洱 665000)

種子休眠是指在預(yù)定的時(shí)間范圍內(nèi)，有生命活力體征的種子在利于其萌發(fā)的環(huán)境因子的組合條件下，本該萌發(fā)但沒(méi)有發(fā)芽的現(xiàn)象[1-4]。許多植物的種子都具有這種現(xiàn)象，這是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中抵抗不良環(huán)境條件所形成的一種生態(tài)適應(yīng)性，是植物適應(yīng)環(huán)境的一種生存策略[5-8]。休眠的種子播種后不能及時(shí)出苗，導(dǎo)致田間出苗斷壟現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，數(shù)年后又淪為田間雜草，這已成為草業(yè)生產(chǎn)嚴(yán)重的限制因素，是亟須解決的問(wèn)題。

雜交臂形草 (Brachiaria hybrid) 為禾本科臂形草屬多年生密叢型草本植物，是中國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)優(yōu)良的放牧及刈割兼用型牧草[9-10]。該牧草喜溫暖潮濕氣候，耐高溫、耐干旱、耐貧瘠、耐酸，亦較耐寒[10-12]，且生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高。但其種子落粒性強(qiáng)，發(fā)芽率低，休眠程度深，嚴(yán)重制約了該種子的推廣應(yīng)用[13-14]。王琰等[9]采用機(jī)械處理破除雜交臂形草種子休眠，發(fā)現(xiàn)去除稃片可顯著提高種子的發(fā)芽率和活力指數(shù)，發(fā)芽率達(dá)到76.00%，活力指數(shù)為0.20，分別是對(duì)照的2.05 和1 034.78 倍。PEREIRA 等[15]研究發(fā)現(xiàn)：在42 ℃和98%的相對(duì)濕度下，長(zhǎng)達(dá)48 h的加速老化有助于‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的發(fā)芽和α-淀粉酶活性的提高。目前，關(guān)于雜交臂形草的相關(guān)研究主要集中在引種栽培和種子生產(chǎn)技術(shù)上，關(guān)于種子休眠方面的研究報(bào)道很少，其休眠的自然釋放及休眠期的長(zhǎng)短對(duì)生產(chǎn)影響很大，研究又尚未涉及。本試驗(yàn)以自然貯藏0～24 個(gè)月的‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草的凈種子為試驗(yàn)材料，每2 個(gè)月取樣1 次，測(cè)定其發(fā)芽率、活力水平及抗氧化酶活性，研究自然貯藏過(guò)程中種子活力及抗氧化酶活性的變化規(guī)律，旨在探明其休眠的自然釋放過(guò)程，確定其休眠期的長(zhǎng)短，為該優(yōu)良牧草的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以云南省普洱市生產(chǎn)的‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草大田種子為原始材料。種子采收后經(jīng)風(fēng)選獲得凈種子，然后將其充分混勻，并裝入尼龍袋，存放于干燥、通風(fēng)的儲(chǔ)藏室內(nèi)自然貯藏0～24 個(gè)月。

1.2 研究方法

1.2.1種子生活力檢測(cè)

試驗(yàn)前即貯藏當(dāng)日，隨機(jī)選取100 粒凈種子，采用TTC 圖像法測(cè)定種子生活力[16]，3 次重復(fù)。

1.2.2種子預(yù)處理

從貯藏之日開始，每2 個(gè)月取樣1 次。取樣前將袋內(nèi)種子攪拌均勻，然后隨機(jī)稱取足量種子置于500 mL的燒杯中，并用1.5%硫酸銅溶液浸種10 min 進(jìn)行消毒，取出后用蒸餾水沖洗3 次，并將表面水分吸干備用。

1.2.3種子發(fā)芽試驗(yàn)

采用紙上發(fā)芽法[17]，隨機(jī)將100 粒種子置于標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽床，在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，3 次重復(fù)。培養(yǎng)箱內(nèi)全天光照，溫度保持在24～26 ℃。發(fā)芽期間，每天定時(shí)澆水并觀察記錄種子的發(fā)芽情況。第10 天統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽勢(shì)，第21 天統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率。試驗(yàn)結(jié)束后，將幼苗置于105 ℃烘箱中殺青15 min，再降至80 ℃干燥24 h，稱其干質(zhì)量，并計(jì)算種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[16]。

式中，Dt為發(fā)芽時(shí)間，d；Gt為與Dt相對(duì)應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)；S為發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束時(shí)正常幼苗單株干質(zhì)量，g。

1.2.4種子生理指標(biāo)測(cè)定

過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[18]、超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法[18]、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法[19]測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析，采用Duncan’s 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的生活力和種子萌發(fā)隨貯藏時(shí)間的變化

經(jīng)TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色處理后，在立體顯微鏡下觀測(cè)到‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種胚被染成紅色的種子占供試種子的64.33%。可見(jiàn)，云南省普洱市生產(chǎn)的‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草凈種子的生活力為64.33%。

圖1 顯示：隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，最后趨于穩(wěn)定。在種子貯藏12 個(gè)月內(nèi)，種子的發(fā)芽率變化不大，與對(duì)照(CK)均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)；貯藏第14 個(gè)月，種子的發(fā)芽率上升到40.00%，是對(duì)照的1.25 倍(P＜0.05)，說(shuō)明休眠已經(jīng)開始釋放；貯藏22 個(gè)月，種子的發(fā)芽率為53.00%，是對(duì)照的1.66 倍(P＜0.05)；貯藏24 個(gè)月，發(fā)芽率略有上升，達(dá)到54.33%，是對(duì)照的1.70 倍(P＜0.05)，但與貯藏22 個(gè)月沒(méi)有差異(P＞0.05)。種子的發(fā)芽勢(shì)在貯藏6 個(gè)月內(nèi)變化不大，與對(duì)照(CK)均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)；貯藏8～20 個(gè)月，發(fā)芽勢(shì)緩慢上升，較對(duì)照均存在顯著差異(P＜0.05)；貯藏第22 個(gè)月后，發(fā)芽勢(shì)趨于穩(wěn)定，至第24 個(gè)月，發(fā)芽勢(shì)達(dá)到53.00%，是對(duì)照的2.27 倍(P＜0.05)，但與貯藏第22 個(gè)月無(wú)差異(P＞0.05)，說(shuō)明種子早已通過(guò)休眠。

圖1 貯藏時(shí)間對(duì)莫拉特Ⅱ雜交臂形草種子的影響Fig.1 Effect of storage time on ‘Morat Ⅱ’ Brachiaria hybrid seeds germination

從圖1 可以看出：‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的活力指數(shù)與發(fā)芽指數(shù)的變化趨勢(shì)相似，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。在種子貯藏4 個(gè)月內(nèi)，種子的發(fā)芽指數(shù)變化不大，較對(duì)照(CK)沒(méi)有差異(P＞0.05)；貯藏6～22 個(gè)月，種子的發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，較對(duì)照均有顯著差異(P＜0.05)；貯藏至第24 個(gè)月，其發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最高值為18.20，是對(duì)照的4.78 倍(P＜0.05)。自然貯藏8 個(gè)月內(nèi)，種子的活力指數(shù)變化不大，較對(duì)照(CK)均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)；貯藏10～22 個(gè)月，種子的活力指數(shù)呈現(xiàn)緩慢上升，與對(duì)照相比均有顯著提高(P＜0.05)；至貯藏24 個(gè)月，種子的活力指數(shù)達(dá)到最大值，為0.085 3，是對(duì)照的7.48 倍(P＜0.05)。

2.2 自然貯藏過(guò)程中雜交臂形草種子抗氧化酶活性的變化

圖2 顯示：‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的SOD 活性與POD的變化情況相似，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。種子在收獲后貯藏當(dāng)日即對(duì)照(CK)的POD 活性最高，為28.33 U/(g·min) (FW)，貯藏2 個(gè)月，POD 活性為26.67 U/(g·min) (FW)，與對(duì)照無(wú)顯著差異(P＞0.05)；貯藏4～24 個(gè)月，POD 活性緩慢下降，但較對(duì)照均有顯著降低(P＜0.05)，至貯藏24 個(gè)月，種子酶活性僅為1.67 U/(g·min) (FW)，較對(duì)照降低94.12% (P＜0.05)。種子在收獲后貯藏當(dāng)日即對(duì)照(CK)的SOD 活性最高，為4 515.15 U/(g·min)(FW)，與貯藏2 個(gè)月種子的SOD 活性差異不大(P＞0.05)；貯藏4～24 個(gè)月，SOD的活性緩慢下降，較對(duì)照均有顯著差異(P＜0.05)；至貯藏24 個(gè)月，其活性降到最低，為107.85 U/(g·min) (FW)，較對(duì)照降低97.61% (P＜0.05)。

圖2 顯示：與POD 和SOD 活性的變化趨勢(shì)相反，在自然貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的CAT 活性呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。種子貯藏2～12 個(gè)月，酶活性增幅不大，較對(duì)照(CK)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；貯藏14～24 個(gè)月，酶活性顯著提高，較對(duì)照及貯藏前期(2～12 個(gè)月)均有顯著差異(P＜0.05)。貯藏24 個(gè)月，種子的CAT 活性最高，為813.66 U/(g·min)，較對(duì)照顯著提高91.29% (P＜0.05)。

圖2 自然貯藏過(guò)程中種子抗氧化酶活性的變化Fig.2 Changes of antioxidant enzymes activity during natural storage

3 討論

3.1 自然貯藏時(shí)間對(duì)雜交臂形草種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽率是衡量種子質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)，反映種子發(fā)芽數(shù)量的多少；發(fā)芽勢(shì)是反映種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要指標(biāo)之一，體現(xiàn)種子發(fā)芽的快慢和整齊度；發(fā)芽指數(shù)反映種子在整個(gè)發(fā)芽期的綜合活力；活力指數(shù)既能反映種子發(fā)芽率和發(fā)芽速度的高低，又能夠反映生長(zhǎng)勢(shì)及生長(zhǎng)活力的強(qiáng)弱[20]。本試驗(yàn)表明：在自然貯藏過(guò)程中，‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的發(fā)芽率和各項(xiàng)活力指標(biāo)均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，與同為熱帶牧草和休眠程度同樣較深的納羅克非洲狗尾草種子的情況[21]類似。

‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草凈種子的生活力為64.33%，貯藏22 個(gè)月時(shí)，其種子的發(fā)芽率達(dá)到53.00%，較貯藏24 個(gè)月沒(méi)有差異(P＞0.05)，說(shuō)明此時(shí)種子的休眠已經(jīng)基本釋放完畢，發(fā)芽率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)繼續(xù)提高的空間越來(lái)越小。從另外一個(gè)角度來(lái)看，貯藏22 個(gè)月時(shí)種子的發(fā)芽率占凈種子生活力的82.39%，按照80.00%具有生活力的種子能正常發(fā)芽作為通過(guò)休眠的標(biāo)準(zhǔn)[16]，也說(shuō)明貯藏22 個(gè)月后種子已經(jīng)通過(guò)休眠。因此，可以確定‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的休眠期為22 個(gè)月。

3.2 自然貯藏過(guò)程中雜交臂形草種子抗氧化酶活性的變化

SOD、POD 和CAT 是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的主要保護(hù)酶系統(tǒng)。POD 是植物體內(nèi)重要的一種抗氧化酶，CAT 是植物體內(nèi)重要的清除酶，兩者協(xié)同作用清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫等活性氧[22]，增強(qiáng)植物的抗逆性。SOD 可以使有害的超氧陰離子自由基發(fā)生歧化作用，形成分子氧和過(guò)氧化氫，從而消除自由基對(duì)植物造成的傷害[23]。楊艷等[24]在研究珙桐(Davidia involucrateBaill)種子休眠解除與萌發(fā)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：種子通過(guò)各抗氧化酶活性間的相互作用，促進(jìn)種子萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子POD 和SOD的活性均逐漸降低，這與王秋爽等[25]研究NaCl 脅迫對(duì)雞冠花(Celosia cristataL.)種子的酶活變化相似。韋小麗等[26]研究指出：隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，麻風(fēng)樹種子SOD 活性逐漸下降；錢秀珍等[27]研究貯藏時(shí)間對(duì)油菜種子生理生化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，種子SOD 活性也逐漸下降。說(shuō)明在貯藏初期雜交臂形草種子的POD 和SOD 酶活性較高，有助于種子休眠解除，為種子休眠釋放創(chuàng)造了有利條件；而隨著自然貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)雜交臂形草種子的CAT 活性則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，這與羅富成等[28]研究種子休眠完全解除之前CAT 活性的變化趨勢(shì)一致，金小雯等[29]也證實(shí)白燕7 號(hào)在4 年的貯藏期內(nèi)，CAT 活性呈上升趨勢(shì)。說(shuō)明種子在自然貯藏過(guò)程中，代謝強(qiáng)度逐漸增加，種子休眠逐漸釋放。

4 結(jié)論

(1)在自然貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的發(fā)芽率和活力水平逐漸升高，貯藏第14 個(gè)月發(fā)芽率為40.00%，種子休眠已經(jīng)開始釋放，至貯藏第22 個(gè)月，種子休眠已經(jīng)釋放完畢，其休眠期為22 個(gè)月。說(shuō)明‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的休眠釋放是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程。

(2)在自然貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，‘莫拉特Ⅱ’雜交臂形草種子的POD 和SOD活性逐漸降低，貯藏初期的高活性為種子休眠的自然釋放創(chuàng)造了有利條件；CAT 活性則逐漸上升，使種子代謝強(qiáng)度逐漸增加，推動(dòng)了種子的休眠釋放過(guò)程。