犬瘟熱診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

程敏姮，張啟龍，潘珺，李蕊，高敏，苗燕，鄭博君，張瑋，傅彩霞

(北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 102629)

犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)屬副黏病毒科，并與麻疹病毒和牛瘟病毒同屬麻疹病毒屬，親緣關(guān)系較近[1]。CDV為不分節(jié)、非重疊、有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒[2]，基因組約包含約15 690個(gè)核苷酸并主要編碼核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白基質(zhì)(L)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)[3-4]。該病毒是一種泛嗜性病毒，可侵害呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，甚至是神經(jīng)系統(tǒng)，從而引起機(jī)體全身性病理變化，造成大批發(fā)病死亡，死亡率在30%～80%之間。CDV宿主廣泛，包括犬科等所有食肉目科以及偶蹄目豬科、鰭足目海豹科、貓科，近幾年大熊貓、老虎、靈長目獼猴科都相繼出現(xiàn)犬瘟熱病例[5-7]。隨著環(huán)境的變化，CDV對(duì)動(dòng)物的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng)，免疫動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率也在升高，即使在美國、日本等大范圍定期接種疫苗的地區(qū)也可能暴發(fā)[8]。迄今為止，對(duì)于該病的防治措施除定期接種疫苗外，尚無特異有效的治療方法。因此，確定一種敏感性高、特異性好、快速簡便且適用于基層快檢或?qū)嶒?yàn)室高通量檢測(cè)的診斷方法尤為重要。

1 臨床診斷

犬瘟熱主要有兩種臨床表現(xiàn)，分別為急性型和慢性型[4]。其中急性型病例呈現(xiàn)雙相熱，出現(xiàn)皮疹、呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、厭食、結(jié)膜炎及黏液或膿性眼鼻分泌物等臨床癥狀。隨著病程發(fā)展，常伴隨有細(xì)菌或支原體二次感染，繼而出現(xiàn)腹瀉、血便、嘔吐等癥狀，部分甚至出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為抽搐、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)、姿勢(shì)反應(yīng)障礙、癱瘓或麻痹，在病程晚期通常出現(xiàn)脫髓鞘性腦炎。慢性型的感染動(dòng)物發(fā)病遲緩，免疫應(yīng)答反應(yīng)不強(qiáng)烈，同時(shí)伴有一些不明顯的早期臨床癥狀。有些毒株感染細(xì)胞能力低，不易形成包涵體，例如A75/17毒株可以入侵大腦某些區(qū)域而未引起炎癥反應(yīng)，且能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)長期存在。

臨床診斷需要豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)才能做出初步診斷，且僅靠臨床癥狀并不能作為犬瘟熱確診的依據(jù)，還需配合其他方法進(jìn)行確診。

2 傳統(tǒng)診斷技術(shù)

2.1 組織病理學(xué)檢測(cè)

CDV經(jīng)呼吸道上皮細(xì)胞感染機(jī)體后入侵淋巴組織、扁桃腺和支氣管淋巴，繼而造成肺、腎、脾臟、心臟、肝臟、胃腸黏膜等組織器官出現(xiàn)出血、腫大等現(xiàn)象。置于光學(xué)顯微鏡下觀察，可見心、腎、肺淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有大量紅細(xì)胞和壞死的肺泡上皮細(xì)胞，腎上皮細(xì)胞發(fā)生核固縮[9]。同時(shí)感染細(xì)胞中可見紅色或暗紅色、勻質(zhì)、邊界清晰的包涵體，一般為圓形或橢圓形，也有呈鐮刀形而緊貼于胞核上的，存在于核內(nèi)的包涵體。包涵體是CDV感染的重要標(biāo)志之一[10]。置于電鏡觀察下，可見犬瘟病毒粒子呈現(xiàn)多形性，多數(shù)為球形，病毒粒子的直徑為110～550 nm之間。核衣殼呈螺旋狀，總長度為1 000 nm，螺旋直徑15～19 nm，螺旋中心5 nm的孔，螺距5～6 nm。病毒有囊膜，其內(nèi)部為M蛋白，后約5 nm，表面為H和F兩個(gè)糖蛋白組成的纖突，長度為9 nm[11]。房紅瑩等[12]將免疫電鏡技術(shù)與離子捕獲電鏡技術(shù)相結(jié)合，建立了改良版離子捕獲電鏡法，提高了完整CDV粒子的檢測(cè)率，其效果要比單純的離子捕獲電鏡法強(qiáng)。

組織病理學(xué)檢測(cè)可以根據(jù)組織病變、病毒結(jié)構(gòu)、典型包涵體等特征，更直觀的鑒別病毒，但是該方法制備過程較為復(fù)雜繁瑣，非專業(yè)人士無法操作，故一般不作為常規(guī)檢查手段，僅限于研究應(yīng)用。

2.2 病毒的分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)是研究病原體最直接的方式，目前常用于CDV病毒分離的細(xì)胞主要有兩類，即原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞系。宋爽[13]驗(yàn)證了9種細(xì)胞對(duì)犬瘟熱病毒的敏感性和操作性，試驗(yàn)表明對(duì)弱毒CDV敏感的細(xì)胞系(Vero等傳代細(xì)胞系)對(duì)臨床流行株不敏感，不能形成CPE，也不感染。John等[14]研究表明在細(xì)胞傳代與接毒時(shí)添加胰酶，細(xì)胞可出現(xiàn)CPE。肺泡巨噬細(xì)胞(DLM)對(duì)臨床流行株敏感且分毒效率較高，但是試驗(yàn)要求高，不適宜推廣使用。而外周血淋巴細(xì)胞(PBL)容易獲得，對(duì)臨床流行株敏感度又高，操作也簡單易行，適宜作為臨床流行株分離的細(xì)胞。對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞系的改造也大大提高CDV分離率，趙建軍等[15]通過建立穩(wěn)定表達(dá)CDV細(xì)胞受體SLAM的Vero細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)了CDV快速分離。

CDV對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較弱，其脂質(zhì)囊膜結(jié)構(gòu)較脆，易被光和熱滅活，因此病毒分離成功率較低。此外CDV分離培養(yǎng)的工作量大，不適宜作為臨床快速診斷的診斷方法。

2.3 免疫學(xué)檢測(cè)

免疫學(xué)檢測(cè)是臨床上較為常用的方法，包括病毒中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光等。病毒中和試驗(yàn)具有較高的特異性，既用于病毒株的種型鑒定，還用于血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定，是國內(nèi)外診斷CDV和臨床上監(jiān)測(cè)免疫效果的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法操作繁瑣、耗時(shí)長、工作量大。Woemle等人于1966年就將瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，1994年我國研究者任文陟等[16]建立了犬瘟熱瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法，并與電鏡結(jié)果相比較，其陽性符合率達(dá)85.7%，總體符合率為90%，該方法操作簡便，但敏感性差。

ELISA在犬瘟熱病毒感染的早期和持續(xù)感染中因快速、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)已廣泛用于CDV的檢測(cè)[17-19]。蔡孜萌等[20]以純化的重組H蛋白作為包被抗原建立了CDV間接ELISA檢測(cè)方法，該方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，與商品化檢測(cè)試劑盒的符合率達(dá)92.5%。Chan等[21]應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)制備CDV 的H蛋白，將其作為檢測(cè)抗原，用于檢測(cè)犬血清中抗體，具有良好的穩(wěn)定性和特異性。Labrini等[22]研究表明直接免疫熒光法具有高特異性和高敏感性，且與PCR檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性，而結(jié)膜細(xì)胞學(xué)檢測(cè)效果差。但ELISA方法存在重復(fù)性差、易出現(xiàn)假陽性等不足，且干擾因素較多，如自身抗體、儀器、操作、溫度等。

2.4 PCR檢測(cè)

Shin等[23]對(duì)建立的RT-PCR和套式PCR進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明套式PCR的敏感性高于普通的一步法RT-PCR。為了同時(shí)檢測(cè)CDV和犬冠狀病毒，Wang等[24]建立了一種快速簡便、高特異性和敏感性的雙重RT-PCR檢測(cè)方法。采用優(yōu)化的雙重RT-PCR方法對(duì)北京、山西和安徽等地區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，其檢出率分別為12.35%、7.5%、13.63%。張洪亮等[25]根據(jù)H基因建立了可鑒別診斷疫苗株和野毒株的RT-PCR-RFLP方法，為臨床上CDV的疫苗株和野毒株的鑒別診斷提供了依據(jù)。

與上述幾種檢測(cè)方法相比，普通RT-PCR具有更高的敏感性和特異性，但相比熒光定量PCR而言，普通PCR存在產(chǎn)物易污染、假陽性、不能定量檢測(cè)等缺點(diǎn)。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR以其敏感、快速等特點(diǎn)越來越多的應(yīng)用在疫病診斷領(lǐng)域。Elia等[26]建立的CDV TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有較高的特異性和敏感性，能夠檢測(cè)100 copies。由叢華等[27]根據(jù)CDV的M基因建立了SYBR Green熒光定量PCR，該方法特異性高、重復(fù)性良好，最低檢出限為10 copies，并能有效鑒別犬瘟熱的強(qiáng)弱毒株。趙雪麗等[28]根據(jù)CDV的H基因和CPV的VP2基因建立了犬瘟熱和犬細(xì)小病毒雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該方法靈敏、特異、高通量和可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，其最低檢出限為10 copies，兩種病毒同時(shí)或單獨(dú)存在，或濃度相差較大時(shí)均不影響對(duì)核酸的定量檢測(cè)。王介淞等[29]根據(jù)CDV的核衣殼蛋白(NP)基因建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該方法可以成功檢出水貂外周血淋巴細(xì)胞中的CDV。近年來吉林、山東、上海等地相繼頒布實(shí)施了以熒光定量PCR為診斷方法的地方標(biāo)準(zhǔn)[30-33]。

與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有高靈敏度、高特異性、高自動(dòng)化、安全無污染等優(yōu)點(diǎn)，可以通過計(jì)算機(jī)和分析軟件實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)和定量分析一體化，同時(shí)杜絕了傳統(tǒng)PCR開放檢測(cè)對(duì)環(huán)境的污染和由此導(dǎo)致的假陽性。但是熒光定量PCR需要特殊的實(shí)驗(yàn)儀器，對(duì)于臨床及基層的普適性較差。

3 快速診斷技術(shù)

3.1 試紙條診斷技術(shù)

犬瘟熱膠體金試紙條是采用膠體金免疫層析技術(shù)研制而成，一般采用雙抗體夾心方式，屬于一步式固相膜反應(yīng)。該方法具有快速、簡便、廉價(jià)、可單份檢測(cè)、穩(wěn)定性好、特異性高、檢測(cè)標(biāo)本種類多等優(yōu)點(diǎn)。目前也是寵物醫(yī)院等臨床用于CDV檢測(cè)中使用最廣泛的檢測(cè)方法。但是該方法的靈敏度和特異性與RT-PCR相比較低，且不能定量檢測(cè)34]，敏感性較低。陳崢嶸[35]根據(jù)179株Asia-Ⅰ型CDV的H基因和3株弱毒疫苗株H基因設(shè)計(jì)出AS-PCR上游特異性引物和下游通用引物，同時(shí)制作相應(yīng)的AS-PCR核酸試紙條，該方法可以區(qū)分野毒株和疫苗株。但該方法可能存在地域限制的不足，其核酸試紙條也沒達(dá)到最優(yōu)預(yù)期效果。

3.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)

RPA是一種新型的等溫基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由2個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。該反應(yīng)在37 ℃左右，一般可在10～20 min獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)靈敏、設(shè)備要求低，適合臨床快速檢測(cè)[36]。已在病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原檢測(cè)方面得到較好的應(yīng)用[37-40]。Wang等[41]建立一套快速、簡便、可靠的RT-RPA檢測(cè)方法，該方法只需在40 ℃下進(jìn)行，反應(yīng)3～12 min即可觀察到結(jié)果，既可用于實(shí)驗(yàn)室診斷也可用于寵物醫(yī)院臨床檢測(cè)，尤其在條件有限的情況下也可完成檢測(cè)。熊煒等[42]建立了一套實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法，該方法在39 ℃恒溫反應(yīng)25 min即可判讀結(jié)果，且具有良好的穩(wěn)定性、可靠性、特異性和敏感性。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是一種新型基因擴(kuò)增方法，其特征是針對(duì)靶基因上的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可在15～60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109～1 010倍擴(kuò)增，反應(yīng)能產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物即焦磷酸鎂白色沉淀，可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷靶基因是否存在。Cho等[43]根據(jù)CDV的N基因建立了RT-LAMP檢測(cè)方法，該方法在65 ℃恒溫下反應(yīng)60 min即可完成，且可直接目視檢測(cè)結(jié)果。與熒光定量PCR相比，檢測(cè)時(shí)間短、操作簡便、可目視觀察結(jié)果。胡嘉欣等[44]建立的CDV RT-LAMP檢測(cè)方法可檢測(cè)到RNA的濃度為5.6×10-6ng/μL，試驗(yàn)過程比國標(biāo)RT-PCR縮短了1.5 h。何麗麗等[45]根據(jù)CDV的N基因建立的RT-LAMP方法可檢測(cè)到70 copies。郝鐲等[46]建立了一種新型、穩(wěn)定、可普遍應(yīng)用的犬瘟熱RT-LAMP-LFD檢測(cè)方法，該方法是將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條相結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，最低檢測(cè)限為100 copies。目前環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已在食品檢測(cè)、結(jié)核病等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[47]，但在動(dòng)物疫病領(lǐng)域應(yīng)用的報(bào)道還較少，LAMP方法的優(yōu)勢(shì)除了高特異性和高靈敏度外，操作還十分的簡單，在應(yīng)用階段對(duì)儀器的要求低，一個(gè)簡單的恒溫裝置就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果檢測(cè)也非常簡單，直接肉眼觀察白色沉淀或者綠色熒光即可，具有高效、快速、便捷的特點(diǎn)，更加適于在臨床和野外監(jiān)測(cè)站進(jìn)行推廣使用。但目前應(yīng)用于犬瘟熱的檢測(cè)方法的最終結(jié)果判定依然是依靠濁度儀、熒光檢測(cè)儀來觀察判定，或是通過濁度目視判定。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是通過把巨量的已知的寡核苷酸、肽核苷酸或cDNA固定在一塊面積很小的硅片、玻片或尼龍膜上而構(gòu)成DNA/RNA微陣列，然后將樣品基因組DNA/RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增并滲入標(biāo)記分子后，與位于微陣列上的已知DNA序列雜交，用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)或質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等檢測(cè)方法檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度。該技術(shù)主要分為兩種，一種是可視化技術(shù)，即將檢測(cè)信號(hào)通過各種方法擴(kuò)大，以便達(dá)到可視化檢測(cè)；另一種是通過提高基因芯片中目的基因載量，該技術(shù)在臨床上對(duì)疫病高通量檢疫有重要影響。汪琳等[48]利用快速、高效、高通量的基因芯片技術(shù)，建立了可同時(shí)檢測(cè)犬傳染性肝炎病毒、CDV和犬細(xì)小病毒的基因芯片篩查檢測(cè)方法，該方法對(duì)CDV的檢測(cè)靈敏度達(dá)100 copies，特異性、重復(fù)性較好，具有實(shí)際應(yīng)用于口岸檢測(cè)的價(jià)值。

基因芯片技術(shù)通過把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速的檢測(cè)和分析。但存在技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、分析范圍狹窄等不足。

3.5 新型基因測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing technologies,NGS)

NGS是一系列在2004年后問世的新的DNA測(cè)序技術(shù)，這些新技術(shù)依靠高度并行的基因序列讀取方式取得高通量DNA測(cè)序，在數(shù)天內(nèi)即可完成第一代基因測(cè)序技術(shù)花費(fèi)10年的人類基因組測(cè)序。NGS又分為第二代測(cè)序和第三代測(cè)序，第二代測(cè)序以Roche公司的454技術(shù)、ABI公司的SOLiD技術(shù)和IIIumina公司的Solexa技術(shù)為代表。其中454測(cè)序的DNA片段無需熒光標(biāo)記，無需電泳，邊合成邊測(cè)序，堿基在加入到序列中時(shí)，會(huì)脫掉1個(gè)焦磷酸，通過檢測(cè)焦磷酸識(shí)別堿基，因此也被稱為焦磷酸測(cè)序。SOLiD以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，可對(duì)單copiesDNA片段進(jìn)行大規(guī)模和高通量并行測(cè)序。Solexa同樣為邊合成邊測(cè)序，該技術(shù)在測(cè)序的過程中，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。因?yàn)閐NTP的羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基，此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，根據(jù)dNTP所帶的熒光讀取每條模板序列每1輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類，經(jīng)過“合成-清洗-拍照”的循環(huán)過程，最終得到目的片段的堿基排列順序。

第三代測(cè)序以O(shè)xford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)為代表，其技術(shù)原理是將含有1對(duì)電極的特殊脂質(zhì)雙分子層置于微孔之上，該雙分子層中含有很多由α溶血素蛋白組成的納米孔，并且每個(gè)納米孔會(huì)結(jié)合1個(gè)核酸外切酶。當(dāng)DNA模板進(jìn)入孔道時(shí)，孔道中的核酸外切酶會(huì)“抓住”DNA分子，順序剪切掉穿過納米孔道的DNA堿基，每個(gè)堿基通過納米孔時(shí)都會(huì)產(chǎn)生一個(gè)阻斷，根據(jù)阻斷電流的變化就能檢測(cè)出相應(yīng)堿基的種類，最終得出DNA分子的序列。Peserico等[49]利用微型納米孔(MinION)測(cè)序技術(shù)成功讀取病死犬腦組織中的犬瘟熱核酸序列，且與RT-PCR和免疫組化檢測(cè)方法具有良好的一致性，該方法通量大、時(shí)間短、精確度高、信息量豐富，在臨床診斷中具有非常好的潛在優(yōu)勢(shì)。

新一代基因測(cè)序技術(shù)相比RT-PCR、熒光定量PCR而言，具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)勢(shì)，但是成本較高不適宜基層臨床大范圍的推廣使用。

4 展望

診斷準(zhǔn)確性高、診斷時(shí)間短、多樣品同時(shí)診斷、診斷設(shè)備簡易且成本低、基層人員即可操作一直是診斷方法的風(fēng)向標(biāo)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，快速、簡便且準(zhǔn)確的診斷技術(shù)一直在不斷優(yōu)化，如納米金、核酸適體、CRISPR/Cas技術(shù)、微流控芯片、可視化芯片技術(shù)、LAMP芯片技術(shù)、新型高通量篩查技術(shù)、宏基因組學(xué)等方法均不斷應(yīng)用于動(dòng)物疫病防控、診斷、治療[50-52]，但在犬瘟熱檢測(cè)方面的報(bào)道研究還很少。對(duì)此，我們有以下三點(diǎn)思考：是否可以利用納米金復(fù)合物為肉眼可見的紅色斑點(diǎn)這一特性，采用免疫層析技術(shù)，制備快速檢測(cè)犬瘟熱的納米金試紙條；CRISPR/Cas技術(shù)是一種高效簡便、能精準(zhǔn)定位并進(jìn)行基因編輯的技術(shù)，是由一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制基礎(chǔ)上發(fā)展的新技術(shù)，能否利用CRISPR的基因編輯系統(tǒng)，開發(fā)用于大熊貓等珍稀動(dòng)物的犬瘟熱的臨床診斷及治療；能否基于宏基因組學(xué)方法建立我市犬瘟熱基因信息文庫，以便高效、快捷地全面分析我市生態(tài)環(huán)境中犬瘟熱病毒分布情況，實(shí)時(shí)掌握我市犬瘟熱病毒流行趨勢(shì)及防控效果，為疫苗的選擇提供更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)資料。

快速檢測(cè)技術(shù)因其低成本、簡便、快速等特點(diǎn)更適合快速篩查和現(xiàn)場檢測(cè)，更受寵物醫(yī)院、動(dòng)物園以及疫病檢測(cè)部門青睞，是基層有效防治犬瘟熱的技術(shù)支撐。但我們認(rèn)為目前的多種快速診斷方法還應(yīng)在以下三個(gè)方面進(jìn)行改良：一是國內(nèi)做快速診斷技術(shù)應(yīng)在確保特異性的前提下進(jìn)一步提高檢出限(limit of detection，LOD)，提高檢測(cè)方法的靈敏度；二是建議將恒溫快速檢測(cè)技術(shù)與目視熒光試劑結(jié)合，在保證不影響擴(kuò)增反應(yīng)的前提下，建立更簡便、更直觀、更客觀的結(jié)果判定方法；三是應(yīng)將納米金、核酸適體、CRISPR/Cas技術(shù)、微流控芯片、可視化芯片技術(shù)、新型高通量篩查技術(shù)、宏基因組學(xué)等方法應(yīng)用于犬瘟熱的檢測(cè)研究中，綜合多方面技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，切實(shí)建立敏感性高、特異性好、快速簡便且適用于基層快檢或?qū)嶒?yàn)室高通量檢測(cè)的診斷方法。