豬源糞腸球菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性分析及其酰胺醇類耐藥基因的檢測(cè)

伊思達(dá)，高懿，陳麗，黃金虎，王曉明，王麗平(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

腸球菌(Enterococcus)雖在人類和動(dòng)物消化道內(nèi)廣泛定植，但也是造成人發(fā)生院內(nèi)感染的重要病原菌之一。臨床分離的腸球菌以屎腸球菌(E.faecium)和糞腸球菌(E.faecalis)為主，主要引起人泌尿系統(tǒng)、皮膚組織、腹腔和腦部感染。腸球菌有較為堅(jiān)厚的細(xì)胞壁，能對(duì)許多抗生素產(chǎn)生固有耐藥性[1]。目前，因抗菌藥物的廣泛應(yīng)用造成的選擇性壓力，腸球菌的耐藥性也不斷增強(qiáng)，尤其是耐萬(wàn)古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococci，VRE)的出現(xiàn)，給人類的感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)，目前VRE菌株已被WHO列為嚴(yán)重威脅人類健康的超級(jí)細(xì)菌之一[2-3]。中國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2015—2018年的數(shù)據(jù)顯示，糞腸球菌對(duì)氨芐西林、高濃度慶大霉素、利福平、環(huán)丙沙星、紅霉素、呋喃妥因、替考拉寧的耐藥率均低于屎腸球菌，對(duì)氯霉素的耐藥率顯著高于屎腸球菌；糞腸球菌對(duì)呋喃妥因和氨芐西林的耐藥率仍保持較低水平，但對(duì)紅霉素和利福平的耐藥率均在55%以上[4-7]。近年來研究顯示，動(dòng)物源性腸球菌不僅會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)相關(guān)感染，而且會(huì)成為腸道菌群中耐藥基因轉(zhuǎn)移的供體菌，由于腸球菌存在通過食物鏈傳播給人以及成為耐藥基因水平轉(zhuǎn)移供體庫(kù)的風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)對(duì)食品安全與人類臨床抗感染治療造成威脅，因而備受關(guān)注，故對(duì)糞腸球菌在內(nèi)的腸球菌進(jìn)行長(zhǎng)期的耐藥性監(jiān)測(cè)也具有重要的公共衛(wèi)生意義[8-10]。

酰胺醇類抗生素(phenicols)包括氯霉素、甲砜霉素以及氟苯尼考，在臨床抗感染治療中對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌及支原體均有較強(qiáng)抗菌活性[11]。隨著該類抗菌藥在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用，動(dòng)物源性糞腸球菌對(duì)其耐藥率也日趨上升[12-14]。腸球菌不僅是人畜共患機(jī)會(huì)致病菌，而且其耐藥相關(guān)可移動(dòng)遺傳元件的種內(nèi)、種間的水平轉(zhuǎn)移可促進(jìn)耐藥性的水平擴(kuò)散，給動(dòng)物和人類以及公共衛(wèi)生安全造成極大的威脅。因此，對(duì)動(dòng)物源性糞腸球菌進(jìn)行長(zhǎng)期的耐藥性監(jiān)測(cè)有助于我們掌握該菌耐藥性變遷的情況，可為抗菌藥物的合理使用提供參考，并進(jìn)一步為深入研究細(xì)菌耐藥產(chǎn)生和傳播機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2016—2017年間，在江蘇省蘇北地區(qū)10個(gè)豬場(chǎng)共采集300份肛門拭子樣品。其中，2016年采集120份樣品，2017年采集180份樣品。

1.2 主要試劑和藥品

四環(huán)素、紅霉素、青霉素G、萬(wàn)古霉素、鏈霉素、慶大霉素，購(gòu)自阿拉丁(Aladdin)公司；麻保沙星、利福平、氟苯尼考，購(gòu)自阿達(dá)瑪斯(Adamas)公司；氨芐西林、利奈唑胺，購(gòu)自麥克林(Macklin)公司；腸球菌肉湯、腸球菌瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯、陽(yáng)離子調(diào)節(jié)MH肉湯、腦心浸液瓊脂，購(gòu)自青島海博生物；1×TE buffer、50×TAE(用前稀釋至1×)，購(gòu)自 Biosharp 公司；2×TaqMaster Mix，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Gold view核酸染料，購(gòu)自南京百斯凱科技有限公司；DNA Maker、瓊脂糖，購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定

取肛門拭子樣品于腸球菌肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，并于腸球菌瓊脂平板上分離培養(yǎng)，挑取菌落周圍變?yōu)楹稚木渑囵B(yǎng)，保存并粗提取菌株DNA用于糞腸球菌PCR反應(yīng)模板。其中特異性引物為：5′-ATCAAGTACAGTTAGTCTTTATTAG-3′和5′-ACGATTCAAAGCTAACTGAATCAGT-3′。目的片段大小為941 bp。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[15]。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定了11種抗菌藥對(duì)臨床分離的豬源糞腸球菌及質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)的最小抑菌濃度(MIC)[16]。

1.3.3 酰胺醇類耐藥基因檢測(cè)

采用PCR的方法檢測(cè)氟苯尼考耐藥糞腸球菌中酰胺醇類耐藥基因fexA、fexB、floR、cfr和optrA。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，加滅菌三蒸水至20 μL。按參考文獻(xiàn)合成的各基因引物序列及退火溫度，產(chǎn)物片段大小見表1。對(duì)擴(kuò)增的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確證為待檢基因。

表1 檢測(cè)耐藥基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌的分離率

2016—2017年從蘇北地區(qū)10個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的300份豬肛門拭子中分離糞腸球菌230株，分離率為76.7%。其中2016年樣品中分離到89株糞腸球菌，2017年樣品中分離到141株糞腸球菌。

2.2 糞腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率分析

230株糞腸球菌對(duì)各種藥物的耐藥率情況見表2，其中，氟苯尼考耐藥菌株為223株，耐藥率高達(dá)97.0%，僅次于四環(huán)素(100%)和紅霉素(98.3%)，對(duì)其他藥物的耐藥率分別為慶大霉素78.7%、鏈霉素75.2%、麻保沙星70.9%、利奈唑胺54.8%、利福平30.4%、氨芐西林1.7%、青霉素G 0.4%，未檢測(cè)到萬(wàn)古霉素耐藥菌株。

表2 豬源糞腸球菌臨床分離株對(duì)11種抗菌藥物的耐藥性 (n=230)

對(duì)臨床分離的糞腸球菌的多藥耐藥情況進(jìn)行分析，多藥耐藥菌株的分布情況如圖1所顯示，結(jié)果顯示所有耐藥糞腸球菌均為多藥耐藥菌株，其中大多數(shù)對(duì)5～8種藥物耐藥，尤以6耐為主，達(dá)27.8%(64株)，另有1株菌表現(xiàn)為同時(shí)對(duì)10種抗菌藥物耐藥。

圖1 豬源糞腸球菌的多藥耐藥菌株分布

2.3 不同年代分離糞腸球菌對(duì)11 種抗菌藥物的耐藥性比較

進(jìn)一步比較了2016和2017年分離的糞腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率(圖2)，結(jié)果顯示2017年分離的豬源糞腸球菌對(duì)獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物青霉素G和人醫(yī)臨床常用的抗菌藥物利福平均高于2016年分離株，而對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率略有下降或持平。

圖2 2016 年和2017 年分離糞腸球菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率比較

2.4 豬源糞腸球菌酰胺醇類耐藥基因的檢出率分析

對(duì)230株糞腸球菌進(jìn)行耐藥基因fexA、fexB、floR、cfr、optrA的檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 豬源糞腸球菌的耐藥基因檢出數(shù)

223株氟苯尼考耐藥糞腸球菌中，30.5%(68/223)的菌株攜帶1種耐藥基因，55.2%(123/223)的耐藥菌株攜帶2種耐藥基因，12.1%(27/223)攜帶3 種耐藥基因， 0.9%(2/223)的菌株攜帶4種耐藥基因，1.4%(3/223)的菌株不攜帶上述任何一種耐藥基因。氟苯尼考耐藥的糞腸球菌耐藥基因譜型見表3所示，最常見的基因譜型為fexA+floR(44.8%)，其次為fexA(24.7%)，另有2 株糞腸球菌同時(shí)攜帶4 種酰胺醇類耐藥基因，表現(xiàn)分別為cfr+optrA+fexA+floR和optrA+fexA+fexB+floR。

表3 氟苯尼考耐藥糞腸球菌的酰胺醇類耐藥基因譜

3 討論

腸球菌因具有獨(dú)特的天然耐藥機(jī)制以及豐富的耐藥相關(guān)水平轉(zhuǎn)移元件，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等，易發(fā)生耐藥基因的水平傳播而獲得耐藥性，因此常被認(rèn)為是耐藥基因的傳遞體[20-21]，故了解腸球菌耐藥性變遷，遏制耐藥菌株流行傳播尤為重要。根據(jù)CHINET 的報(bào)導(dǎo)[4-7, 22]，糞腸球菌對(duì)紅霉素與利福平的耐藥率均處于一個(gè)比較高的水平(>55%)。本試驗(yàn)中的豬源性糞腸球菌對(duì)紅霉素(98.3%)和利奈唑胺(54.8%)的耐藥率均高于同年人分離菌株對(duì)紅霉素(64.0%)與利奈唑胺(1.9%)的耐藥率，但人源性糞腸球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率(69.5%～81.8%)低于豬源性糞腸球菌(100%)[23-26]，推測(cè)其主要原因?yàn)槿伺c豬抗菌藥物的用藥環(huán)境差異，并且由于近年來人醫(yī)抗感染治療中抗生素的使用管控較為嚴(yán)格，抗生素使用減少，而相對(duì)于人醫(yī)，獸醫(yī)抗感染治療仍存在著抗生素濫用、管控不嚴(yán)格等現(xiàn)象，也是豬源性糞腸球菌耐藥率普遍高于人源性糞腸球菌的重要原因。值得注意的是，豬源性糞腸球菌的氟苯尼考耐藥率高達(dá)97.0%，這種極高的耐藥率在之前的報(bào)道中從未出現(xiàn)過，可能與氟苯尼考作用獸醫(yī)常用廣譜抗生素廣泛用于豬的細(xì)菌性疾病的治療有關(guān)。在本次樣品中利奈唑胺耐藥菌株的分離率較高(54.8%)，而利奈唑胺作為人醫(yī)臨床專用抗菌藥物，未被批準(zhǔn)用于動(dòng)物，其耐藥性的產(chǎn)生與菌株攜帶的耐藥基因optrA相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)該基因可同時(shí)使菌株對(duì)氟苯尼考的敏感性下降，故利奈唑胺耐藥性的產(chǎn)生可能與氟苯尼考在養(yǎng)豬業(yè)中的廣泛使用有關(guān)[19]。在本次蘇北豬場(chǎng)分離的豬源性糞腸球菌中未發(fā)現(xiàn)VRE，這并不意味著可以放松警惕，萬(wàn)古霉素作為抗革蘭陽(yáng)性菌感染最后一道防線，仍需要嚴(yán)格防控萬(wàn)古霉素耐藥菌株以及萬(wàn)古霉素耐藥基因的傳播以及轉(zhuǎn)移。多重耐藥的出現(xiàn)給臨床抗感染帶來了極大的挑戰(zhàn)[27-28]。在本次分離的豬源性糞腸球菌中多為多藥耐藥菌株，其中以5～8耐為主，這就表明一些傳統(tǒng)的聯(lián)合用藥治療方法可能會(huì)失去意義。上述信息應(yīng)該引起高度的重視，相關(guān)部門應(yīng)該完善相關(guān)法律法規(guī)嚴(yán)格控制抗生素的使用，一線醫(yī)護(hù)人員應(yīng)嚴(yán)格遵守抗生素使用規(guī)范并采取有效的感染防治措施防控、防止耐藥菌株大范圍傳播，科研人員應(yīng)定期實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)菌耐藥性的變化。

由于氟苯尼考在獸醫(yī)臨床中的重要地位，本研究對(duì)其耐藥基因fexA、fexB、floR以及多藥耐藥基因cfr進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。fexA、fexB、floR為外排泵基因，其編碼的外排泵蛋白可同時(shí)介導(dǎo)氯霉素與氟苯尼考的耐藥；cfr基因編碼的則可以編碼23S rRNA甲基化酶并同時(shí)提高菌株對(duì)酰胺醇類、噁唑烷酮類、林可霉素類、截短側(cè)耳素類和鏈陽(yáng)菌素A等5類藥物的耐藥水平[11-12,14,17]；optrA基因編碼的ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則能夠賦予對(duì)利奈唑胺和泰地唑胺以及酰胺醇類的可轉(zhuǎn)移抗性[19]。上述基因均可以通過轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒在多種類型的腸球菌，葡萄球菌以及一些陰性菌中轉(zhuǎn)移[29-30]。本試驗(yàn)中，223株分離的氟苯尼考耐藥糞腸球菌中，152株攜帶2種以上的耐藥基因，說明了氟苯尼考耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，多種耐藥機(jī)制相互協(xié)同提升耐藥水平。有3株氟苯尼考耐藥菌中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)耐藥基因，推測(cè)可能有其他耐藥機(jī)制，值得進(jìn)一步探究。