山銀花提取物對肉雞口服氟苯尼考藥代動力學(xué)及代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)的影響

李旭廷，王斌，李思聰，袁定勝，張敏，李金良，梁歌*

(1. 四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；2. 動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)FC)是畜禽專用的新型廣譜抗菌藥，抗菌活性強于氯霉素和甲砜霉素，主要作用機制為抑制細(xì)菌70S核糖體，干擾蛋白質(zhì)的合成[1]。在獸醫(yī)治療中，氟苯尼考具有吸收良好、體內(nèi)分布廣泛、抗菌譜廣、抗菌作用強的特點，多用于畜禽和水產(chǎn)動物的細(xì)菌性疾病，具有良好的治療效果[2-4]。隨著氟苯尼考的持續(xù)廣泛使用，臨床耐藥菌株不斷增加，新型耐藥機制不斷發(fā)現(xiàn)，不僅降低臨床治療效果甚至對人類健康造成潛在的風(fēng)險[5]。養(yǎng)殖生產(chǎn)中為了提高疾病治療效果，常采用氟苯尼考和其他藥物聯(lián)合使用，特別是與中獸藥聯(lián)合應(yīng)用。研究表明包括細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein, MDR1)、乳房癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)以及雞外源性核受體(CXR)在內(nèi)的多種代謝酶和外排轉(zhuǎn)運體參與氟苯尼考代謝轉(zhuǎn)運[6-11]。氟苯尼考在與這些代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的底物、誘導(dǎo)劑或抑制劑聯(lián)用時有可能改變氟苯尼考藥動學(xué)特征，影響氟苯尼考藥效。因此，開展聯(lián)用藥物對氟苯尼考藥代動力學(xué)影響的研究，有助于為氟苯尼考臨床合理使用提供科學(xué)依據(jù)，減少藥物濫用和耐藥性的產(chǎn)生[12]。

山銀花性味甘，寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒，散熱疏風(fēng)之功能，作為清熱解毒類代表性藥物廣泛用于溫病發(fā)熱，風(fēng)熱感冒，肺熱咳嗽，咽喉腫痛，熱毒血痢，乳房腫痛，癰腫瘡毒，收載于《中國獸藥典》(2015年版，二部)[13]，含有山銀花的中獸藥制劑廣泛用于獸醫(yī)臨床?；诋?dāng)前中獸藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖實踐中普遍存在，山銀花與氟苯尼考都是臨床常用藥物，有必要從中西藥相互作用角度，開展山銀花對氟苯尼考在雞體內(nèi)藥動學(xué)影響, 探討可能發(fā)生的藥動學(xué)相互作用及其機制，為臨床安全、合理、有效用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物

山銀花提取物(含綠原酸25.4%、灰氈毛忍冬皂苷乙18.6%、川續(xù)斷皂苷乙1.2%，批號20190601)，由四川鼎尖動物藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；氟苯尼考對照品(含量99.1%，批號K0301703)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.8%，批號130555-201704)，購自中國食品藥品檢定研究院；氟苯尼考原料藥(含量98.9%，批號201710163)，購自浙江康牧藥業(yè)有限公司；UNlQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒(批號B511321)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Maxima Reverse Transcriptase(批號P0743)，購自賽默飛世爾科技有限公司。乙腈為色譜純，乙酸乙酯等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 試驗動物與分組

30只50日齡健康大恒699商品肉公雞，體重(2.50±0.15)kg。試驗前觀察飼養(yǎng)1周。觀察飼養(yǎng)結(jié)束后，隨機分為對照組和山銀花組，每組15只。山銀花組連續(xù)7 d每天上午9點灌服給藥山銀花提取物(0.20 g/kg，1次/d)，對照組則給予相應(yīng)體積的生理鹽水。試驗全程室溫維持在(22±2)℃，濕度(65±5)%，試驗雞自由飲水和采食，飼料為不含任何抗生素的全價日糧。

1.3 山銀花提取物對雞口服氟苯尼考藥代動力學(xué)影響

1.3.1 給藥方案

各組隨機選取10只雞，在禁食12 h后于第8天，按30 mg/kg氟苯尼考(用10%聚乙二醇400溶液制成含氟苯尼考1%的溶液，臨用前配制)灌服給藥，分別于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h翅下靜脈采集血液約0.5 mL，EDTA抗凝，4 000 r/min離心5 min，分離血漿，置-20 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 樣品處理

精確取血漿0.2 mL于試管中，加入10 μL氯霉素內(nèi)標(biāo)液(500 μg/mL)和800 μL乙酸乙酯，渦動混合2 min，4 000 r/min離心10 min，吸取上層液于另一離心管中，然后再加入乙酸乙酯800 μL重復(fù)提取1次，合并2次提取液。在40 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣加入400 μL流動相溶解，渦動混合2 min，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至進樣瓶，取20 μL進樣檢測。色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(27∶73，V/V)；流速1.0 mL/min；檢測波長223 nm；柱溫40 ℃。

1.3.3 分析方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線

以血漿樣品高、中、低(0. 1、2. 5和20 mg/L)3個濃度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度，每個樣品做5個重復(fù)，測方法回收率和精密度。取空白血漿180 μL，加入20 μL氟苯尼考系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“1.3.2”項下方法處理樣品，以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值(s)對相應(yīng)氟苯尼考濃度(c)作線性回歸，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4 山銀花提取物對雞肝臟和空腸代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

1.4.1 樣品采集

2組各取5只雞在禁食12 h后于第8天放血處死，分離肝臟和空腸組織于-80 ℃保存。

1.4.2 熒光定量RT-PCR檢測雞肝臟和空腸代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

取100 mg組織用組織破碎儀進行破碎，按照說明書用TRIzol法提取組織總RNA。測定樣品OD260 nm/OD280 nm比值，確定RNA濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，利用Premier 5.0軟件設(shè)計CYP3A37、UGT1E、MDR1、CXR和看家基因β-actin引物序列(由上海生工生物公司合成)。實時熒光定量PCR檢測上述基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，55～61 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共45個循環(huán)；60 ℃延伸1 min。結(jié)果采用相對定量分析，用2ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

由DAS 2.0軟件以非房室模型分析方法計算藥代動力學(xué)參數(shù)，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件ANOVA單因素方差法處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟苯尼考檢測方法專屬性、回收率、精密度和標(biāo)準(zhǔn)曲線

本色譜條件下，氟苯尼考保留時間約10.5 min，氯霉素(內(nèi)標(biāo))保留時間約12.4 min。氟苯尼考與內(nèi)標(biāo)分離良好，樣品處理過程中未引入干擾性雜質(zhì)，內(nèi)源性成分不干擾藥物的分離測定(圖1)。

A. 空白血漿樣品色譜；B. 血漿樣品色譜(1. 氟苯尼考；2. 內(nèi)標(biāo)物)

氟苯尼考在質(zhì)量濃度為0.05～50 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為s=0.073 5c-0.014 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。方法回收率分別為(84.5±2.6)%、(86.3±2.2)%和(85.4±3.4)%，測得日內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.7%、2.4%和5.6%，測定日間RSD分別為4.8%、3.1%和6.2%。按信噪比S/N=3計算，最低檢測限為0.02 μg/mL。

圖2 血漿藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 山銀花提取物對雞口服氟苯尼考藥代動力學(xué)影響

對照組與山銀花提取物聯(lián)用組雞均按單劑量(30 mg/kg)給予氟苯尼考后，測定不同時間點的氟苯尼考血藥濃度，其血藥濃度-時間曲線見圖3，藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。

表2 對照組與山銀花提取物聯(lián)用組在雞體內(nèi)的氟苯尼考(30 mg/kg)藥動學(xué)參數(shù)(n=10)

圖3 對照組和山銀花提取物聯(lián)用組在雞體內(nèi)的氟苯尼考(30 mg/kg)的血藥濃度-時間曲線(n=10)

由表3可知，山銀花組氟苯尼考的藥-時曲線下面積(AUC0～24 h)和平均滯留時間(MRT0～24 h)顯著高于對照組相應(yīng)的AUC0～24 h和MRT0～24 h(P<0.05)；山銀花組表觀清除率(CLz)顯著低于對照組(P<0.05)；最大血藥濃度(Cmax)、達(dá)峰時間(Tmax)、消除半衰期(t1/2z)和表現(xiàn)分布容積(Vz)與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.3 山銀花提取物對雞肝臟和空腸不同基因表達(dá)的影響

如圖4所示，雞按每千克體重0.20 g連續(xù)口服7 d山銀花提取物后，肝臟和空腸中CYP3A37、UGT1E和CXR 基因的mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)，MDR1的mRNA表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。

*表示與對照組比差異顯著(P<0.05)

3 討論

本次試驗山銀花劑量選擇參照《中國獸藥典》(2015年版，二部)[13]推薦的雞的用量1～3 g，以成年肉雞體重2.5 kg計算，折合提取物用量在0.2 g/kg，按照藥物相互作用指導(dǎo)原則和臨床中西藥聯(lián)用實際，采用山銀花提取物連續(xù)口服7 d，氟苯尼考按30 mg/kg一次給藥的方式開展研究。聯(lián)用山銀花提取物后AUC0～24 h、MRT0～24 h增加，CLz減少，表明山銀花提取物對氟苯尼考吸收有一定促進作用，清除速率有所降低，增加了生物利用度。CYP3A負(fù)責(zé)超過50%的化合物氧化代謝，是非常重要的I相代謝酶，CYP3A37是禽類CYP3型中的主要亞型[14]。王國永[11]采用酮康唑抑制CYP3A37活性后，氟苯尼考AUC0～t顯著提高，清除速率CLz顯著下降，采用糖蛋白(P-gp)抑制劑維拉帕米后，氟苯尼考血藥Cmax顯著上升而AUC0～t無顯著差異，表明CYP3A37是氟苯尼考在雞體內(nèi)代謝的主要I相代謝酶，而P-gp可影響氟苯尼考吸收過程。本試驗結(jié)果中山銀花提取物顯著抑制肝臟和空腸CYP3A37的mRNA表達(dá)，可能產(chǎn)生I相代謝酶抑制作用，減少氟苯尼考在腸道中代謝損失，增加氟苯尼考在空腸中的吸收，減緩氟苯尼考體內(nèi)代謝。

CXR作為核受體家族一員，與哺乳動物孕烷受體(pregnane X receptor, PXR)、雄甾烷受體(constitutive and rostane receptor, CAR)功能相似，都能調(diào)控CYP450酶和MDR1基因表達(dá)[15-16]。本研究采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測到肝臟和空腸組織中CYP3A37 mRNA表達(dá)水平顯著下降，與肝臟和空腸組織中CXR mRNA表達(dá)水平下降有一定相關(guān)性，佐證了前人研究[16]。但MDR1的mRNA表達(dá)水平差異不顯著，缺乏與CXR關(guān)聯(lián)性，提示MDR1的調(diào)控更為復(fù)雜，不僅受CXR通路影響。此外，UGTs是重要的Ⅱ相代謝酶，負(fù)責(zé)將化學(xué)物質(zhì)葡萄糖醛酸化，增加代謝物水溶性，易于代謝排出[17]。氟苯尼考屬于氯霉素類抗生素，在體內(nèi)可通過UGTs代謝轉(zhuǎn)化[18]。本試驗中山銀花提取物顯著抑制UGT1E的mRNA表達(dá)，可能產(chǎn)生Ⅱ相代謝酶的抑制作用，從而調(diào)控氟苯尼考體內(nèi)葡萄糖醛酸化，延緩了氟苯尼考在體內(nèi)的代謝。

山銀花主產(chǎn)于四川、重慶、湖南等南方省市，品種包括灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬和黃褐毛忍冬，與金銀花同屬忍冬科中藥材，二者主治功能、用法用量均完全一致，在長期的臨床實踐中也經(jīng)?；煊肹19]，而山銀花產(chǎn)地廣、產(chǎn)量大、價格低，探討山銀花在畜禽中的藥理藥效機制對拓展其在畜牧健康養(yǎng)殖中應(yīng)用具有顯著意義。綠原酸作為山銀花和金銀花共有的有效成分對CYP450酶活性和P-gp活性影響的研究已見報道。徐文等[20]研究顯示綠原酸對重組人CYP3A4酶活性有較強的抑制作用。Pang等[21]研究顯示綠原酸在體內(nèi)對小鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1和CYP3A11的mRNA表達(dá)無顯著影響，但可體外抑制CYP1A2、CYP2E1酶活性。山銀花及其質(zhì)量控制成分灰氈毛忍冬皂苷乙等對雞CYP450酶和P-gp活性影響未見研究報道，本試驗以雞為靶動物，聯(lián)用山銀花提取物后，氟苯尼考AUC增加26.0%、MRT延長21.4%、CLz降低18.5%，藥代學(xué)特征的改變可能與山銀花提取物抑制了雞體內(nèi)Ⅰ相和Ⅱ代謝酶以及P-gp蛋白表達(dá)有關(guān)，應(yīng)進一步探討其他有效成分對藥物代謝酶和P-gp等轉(zhuǎn)運體影響研究。

綜上所述，以0.2 g/kg連續(xù)7 d口服山銀花提取物可使氟苯尼考在雞體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)(AUC、MRT和CLz)發(fā)生顯著變化，同時對雞肝臟和空腸部分代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)基因如CYP3A37、UGT1E和CXR的mRNA表達(dá)有一定抑制作用。