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    lnc-005028序列及其在鵝肥肝形成中的作用

    2021-10-15 01:43:56陳雪霏唐彬鋮胡博劉賀賀胡繼偉胡深強(qiáng)韓春春何樺王繼文李亮
    畜牧與獸醫(yī) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:棕櫚原代脂肪肝

    陳雪霏, 唐彬鋮,胡博,劉賀賀,胡繼偉,胡深強(qiáng),韓春春,何樺,王繼文,李亮

    ( 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究院,四川 成都 611130 )

    肝臟作為脂質(zhì)代謝的主要器官之一,對(duì)脂質(zhì)具有吸收、合成、氧化和分泌的能力,并且這些過程都會(huì)影響肝臟的脂質(zhì)含量[1]。當(dāng)肝臟中甘油三酯(TG)含量超過肝臟總重量的5%時(shí),TG的生成速度快于極低密度脂蛋白(VLDL),臨床上將其定義為脂肪肝。脂肪肝存在于許多動(dòng)物中,如長途遷徙的野鳥和哺乳期的奶牛[2]。作為候鳥的后代,鵝具有從重度脂肪肝中恢復(fù)的能力,且無明顯的病理癥狀[3],表明鵝存在一種調(diào)節(jié)機(jī)制能保護(hù)其肝臟免受嚴(yán)重脂肪肝的影響。在實(shí)際生產(chǎn)中,鵝肥肝是對(duì)鵝進(jìn)行短時(shí)間碳水化合物填飼導(dǎo)致大量 TG 沉積于肝臟的產(chǎn)物,富含不飽和脂肪酸(60%以上)、人類必須氨基酸和卵磷脂,具有降血脂、降膽固醇和預(yù)防心腦血管等疾病的功能[4]。相反,哺乳動(dòng)物非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種代謝性疾病,通常伴有炎癥和肝硬化。中國長三角等發(fā)達(dá)地區(qū)NAFLD患病率逐年上升,而肥胖是導(dǎo)致哺乳動(dòng)物脂肪肝的主要原因[5],若患者還伴隨有糖尿病等疾病,機(jī)體內(nèi)環(huán)境和免疫系統(tǒng)功能受損,不能清除異常的變異細(xì)胞,還會(huì)發(fā)生癌變[6]。與哺乳動(dòng)物中的NAFLD類似,鵝脂肪肝與能量攝入過多(如高糖或高脂飲食)有關(guān)[7],表明鵝可能與哺乳動(dòng)物存在一些共同之處,使得鵝成為肝臟脂質(zhì)代謝獨(dú)特的研究模型。因此,通過對(duì)鵝肝脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的研究,可為NAFLD以及鵝肥肝的形成提供借鑒和參考。

    長非編碼RNA(long non-codingRNAs,lncRNAs)是長度大于200 nt且不編碼蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄本。lncRNA可通過與DNA、RNA或蛋白結(jié)合在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平控制基因的表達(dá),因此與mRNA相比更具有多樣性,功能更繁復(fù)[8]。隨著高通量測序等先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展,越來越多l(xiāng)ncRNA的調(diào)控作用被發(fā)現(xiàn)并用于相關(guān)疾病的治療,包括X-染色質(zhì)激活、p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、癌癥轉(zhuǎn)移以及重新編程誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,其作用范圍幾乎涉及到生命活動(dòng)的所有方面[9]。目前,在脂質(zhì)代謝方面,已通過RNA-seq和生物信息學(xué)分析鑒定了許多與脂質(zhì)代謝相關(guān)的lncRNA。如在雞腹部脂肪前體細(xì)胞分化的不同階段發(fā)現(xiàn)了1 336個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs,涉及糖脂代謝、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)通路[10]。通過對(duì)填飼前后的鵝肝進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn)302個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs,其中l(wèi)nc-005028表達(dá)水平在填飼后發(fā)生了顯著下降[11]。然而,這些脂質(zhì)代謝相關(guān)的lncRNA在家禽上的功能研究很少。因此,進(jìn)一步開展脂質(zhì)代謝相關(guān)lncRNA的功能研究,可為探討lncRNA調(diào)節(jié)家禽脂質(zhì)代謝的機(jī)制提供參考和借鑒。本試驗(yàn)將研究lnc-005028的序列及其在鵝肥肝形成過程中的可能作用,可為研究鵝肥肝形成機(jī)制提供新的參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    所有動(dòng)物處理程序均經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn),所用試驗(yàn)動(dòng)物四川白鵝來源于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽飼養(yǎng)試驗(yàn)場。將12只14周齡健康四川白鵝公鵝隨機(jī)分為填飼組和對(duì)照組,每組6只,其中填飼組所用飼料為煮熟并鹽漬的玉米(14 MJ/kg,9%蛋白質(zhì)和0.45%脂肪)、0.4%水禽脂肪和水,填飼步驟參照文獻(xiàn)[12];對(duì)照組自由采食,飼料喂煮熟玉米。在過度喂養(yǎng)期間,所有的鵝都可以自由飲水。保持室溫15~18 ℃,濕度70%~80%,持續(xù)2周,最后12 h僅為2組試驗(yàn)動(dòng)物提供自由飲水,在試驗(yàn)第14天時(shí)取填飼組和對(duì)照組四川白鵝的部分肝臟、心臟、腎臟、腿肌、胸肌、皮脂和腹脂于2 mL離心管,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱待用。

    1.2 lnc-005028的克隆與序列分析

    引物采用Primer Premier 5軟件(Primer Biosoft International, Palo Alto, USA)設(shè)計(jì)并由北京六合華達(dá)基因科技有限公司(中國)合成(表1)。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體(TaKaRa, Japan)中,轉(zhuǎn)化為大腸桿菌DH5α細(xì)胞后冰浴30 min,接著42 ℃水浴45 s,冰浴2 min,隨后移入800 mL液體培養(yǎng)基,37 ℃搖床,速度150 r/min,45 min后取出菌液,8 000 r/min離心5 min,棄800 mL上清液后,混勻分散打到固體培養(yǎng)基上,用涂抹棒向一個(gè)方向畫圓涂抹均勻,放入37 ℃恒溫箱,30 min后翻板,12 h后挑菌,37 ℃搖床,速度175 r/min,時(shí)間不少于4 h。陽性克隆產(chǎn)物由北京六合華大基因科技有限公司篩選測序,測序得到的cDNA片段用Editseq和Seqman編輯組裝(DNAStar, Inc., Madison, USA)。

    1.3 鵝原代肝細(xì)胞分離與培養(yǎng)

    將8日齡禁食12 h后的四川白鵝靜脈注射戊巴比妥鈉(每千克體重30 mg)使其完全昏迷,再靜脈注射肝素鈉(100 IU/kg)。腹部切開后取出全肝,立即用37 ℃生理鹽水清洗表面。用100 mL 0.05% IV型膠原酶灌流液(GIBCO, USA)反復(fù)灌流至包膜下組織裂開,撕開后膜,切肝,置37 ℃水浴中振蕩10 min。搖勻后加入含10%胎牛血清(Clark, Australia)的5 mL高糖培養(yǎng)基DMEM(GIBCO,USA)終止消化,200 目無菌過濾器過濾。濾液在室溫下以950 r/min離心2 min,用含10%胎牛血清的DMEM稀釋沉淀后,以細(xì)胞3×105個(gè)/mL的密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。5% CO2和37 ℃下培養(yǎng)6 h后用PBS洗滌3次,用含有10%牛血清白蛋白(BSA)和2% BSA的DMEM稀釋棕櫚酸(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)和油酸(0.25、0.5、0.75、1 mmol/L)并對(duì)原代肝細(xì)胞進(jìn)行處理,對(duì)照組僅用10% BSA和2% BSA的DMEM 處理,24 h后用PBS清洗并收集原代肝細(xì)胞。每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

    1.4 總RNA提取和熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測

    根據(jù)TRIzol(Invitrogen, USA)說明書對(duì)組織和細(xì)胞樣品的總RNA進(jìn)行提取和純化,并分別用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法(UV-1201; Shimadzu, Japan)檢測總RNA的數(shù)量和質(zhì)量。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物(12.5 mL)中含有6.25 mL SYBR?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa, China),各0.5 mL正反向引物(10 mmol/L),1 mL cDNA和4.25 mL ddH2O,ddH2O代替引物反應(yīng)作為空白對(duì)照。將混合物500 r/min離心5 min后,95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,特定溫度下退火30 s,72 ℃延伸30 s,共34個(gè)循環(huán);最后72 ℃延長10 min。設(shè)計(jì)引物:脂肪酸氧化相關(guān)基因:肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)、PPARα;TG合成相關(guān)基因:二?;视王;D(zhuǎn)移酶2(DGAT2)、長鏈脂肪酸延長酶(ELOVL6);促進(jìn)炎癥基因:白細(xì)胞介素-6(IL-6);促進(jìn)凋亡基因:半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)(表1)。使用Roche LightCycler?480 Ⅱ(Roche, Switzerland)對(duì)陰性對(duì)照(ddH2O為模板)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并通過β-actin和GADPH對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.5 統(tǒng)計(jì)分析

    基因的相對(duì)表達(dá)水平用標(biāo)準(zhǔn)化相對(duì)定量法和2-ΔΔCt法計(jì)算。使用IBM SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(Version 22.0, 2014)Student’st檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。所有結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 序列信息與蛋白質(zhì)編碼能力

    通過測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)lnc-005028共有1 066 bp,將獲得的序列與NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上鵝轉(zhuǎn)錄組NW_013185654.1:10248135-10249201的序列相對(duì)比,匹配率為99.34%,差異表現(xiàn)為MN_.1:n.234A>G,MN_.1:n.628C>T,MN_.1:n.898T>A,MN_686114.1:n.898T>A。

    通過ORFfinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder) 在lnc-005028中共發(fā)現(xiàn)18個(gè)開放閱讀框(ORF),長度均小于200 nt,所有正義短肽(+)均與同源蛋白不匹配(表2)。已將lnc-005028的具體序列提交給NCBI,檢索號(hào)為MN686114。

    表2 lnc-005028序列中的ORF

    2.2 填飼對(duì)lnc-005028的影響

    lnc-005028在填飼組和對(duì)照組四川白鵝的肝臟、腎臟、心臟、胸肌、腿肌、皮脂和腹脂中均有表達(dá)(圖1)。在對(duì)照組中,lnc-005028在肝臟中的表達(dá)水平極顯著高于其他組織(P<0.01)。與對(duì)照組相比,填飼組鵝肝臟中l(wèi)nc-005028表達(dá)水平出現(xiàn)極顯著下降(P<0.01),但腎臟、脾臟、心臟、胸肌、腿肌、皮脂和腹脂中l(wèi)nc-005028表達(dá)量均出現(xiàn)極顯著上升(P<0.01)。在填飼組中,肝臟中l(wèi)nc-005028的表達(dá)量與皮脂無顯著性差異(P>0.05),但仍極顯著高于其他組織(P<0.01)。

    相同組織組間比較,大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01);同一處理組不同組織與肝臟相比,**表示P<0.01

    2.3 棕櫚酸對(duì)鵝原代肝細(xì)胞lnc-005028的影響

    根據(jù)qRT-PCR研究結(jié)果,lnc-005028在鵝原代肝細(xì)胞中的表達(dá)水平不隨油酸濃度的增加而變化(P>0.05)(圖2A),而在棕櫚酸的處理下,lnc-005028呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,在0.2 mmol/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,在0.6 mmol/L時(shí)達(dá)到最低(P<0.01)(圖2B)。隨后在不同濃度棕櫚酸處理過的鵝原代肝細(xì)胞中檢測了caspase-3、CPT1、DGAT2、ELOVL6、IL-6和PPARα,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PPARα、caspase-3和IL-6 在0.2 mmol/L棕櫚酸濃度下均顯著升高(P<0.01),但只有caspase-3在0.4和0.6 mmol/L時(shí)顯著下降(P<0.01),在0.8 mmol/L時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)(圖2C)。

    與對(duì)照(NC)組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01

    3 討論

    分子生物學(xué)研究的焦點(diǎn)以往大部分集中在蛋白質(zhì)編碼基因上,lncRNA在發(fā)現(xiàn)之初被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄噪音而一直被忽視。除了ORF,lncRNA一般與mRNA無生化區(qū)別,但其長度普遍更短,具有較少且較長的外顯子,一級(jí)序列保守性低,細(xì)胞特異性、組織特異性和不同發(fā)育階段的疾病特異性更強(qiáng)[13]。先前的研究通過高通量測序發(fā)現(xiàn)lnc-005028屬于鵝的lncRNA,本試驗(yàn)確定lnc-005028總長1 066 bp,在鵝的肝臟中特異性高表達(dá),且ORF均無蛋白編碼能力,再一次驗(yàn)證lnc-005028屬于鵝lncRNA一員。

    lncRNA控制代謝組織的發(fā)育和功能,包括棕色和米色脂肪細(xì)胞分化、肝臟脂質(zhì)代謝、骨骼和心肌發(fā)育等,是多種生物過程中必不可少的調(diào)節(jié)因子[14]。lncRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、神經(jīng)疾病進(jìn)展和癌癥轉(zhuǎn)移成為脂質(zhì)代謝的調(diào)控因子,尤其是調(diào)控脂肪生成、脂肪酸、膽固醇和磷脂代謝和轉(zhuǎn)運(yùn),以及高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的形成,從而參與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[15]。肝臟在多種代謝調(diào)控中起著舉足輕重的作用,包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝、膽汁酸合成、異生化合物的解毒功能以及大量血漿蛋白的分泌[16]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(MALAT1)是最早發(fā)現(xiàn)的與癌癥轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)的lncRNA,能通過上調(diào)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT1)[17]或作為miR-101b的ceRNA調(diào)節(jié)Rac1的表達(dá)[18]。在丙型肝炎病毒感染引起的肝纖維化中,轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)活化lncRNA(ATB)與β-catenin 表達(dá)均增加[19]。肝癌上調(diào)基因(HULC)是第一個(gè)在肝癌細(xì)胞中特異性高表達(dá)的lncRNAs,它誘導(dǎo)miR-9啟動(dòng)子的CpG島甲基化,并在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)miR-9靶向PPARα的能力。lncRNA不僅可以促進(jìn)肝臟的纖維化,也可以抑制脂肪肝的形成。研究發(fā)現(xiàn),用四氯化碳誘導(dǎo)人與鼠的肝臟發(fā)生纖維化后,母系印記基因3(MEG3)表達(dá)水平明顯下降,過表達(dá)MEG3能激活p53并介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放,從而引起caspase-3依賴的造血干細(xì)胞(HSCs)凋亡[20]。lncLSR可以抑制VLDL介導(dǎo)的TG代謝,減少胰島素抵抗的發(fā)生,抑制脂肪肝[21]。本試驗(yàn)對(duì)四川白鵝進(jìn)行填飼后,lnc-005028在鵝肝中的表達(dá)發(fā)生了顯著下降,不再呈現(xiàn)組織特異性,提示肝臟脂質(zhì)代謝的狀態(tài)可以影響lnc-005028的表達(dá)。在細(xì)胞試驗(yàn)中,經(jīng)棕櫚酸處理的原代肝細(xì)胞lnc-005028表達(dá)水平變化趨勢與鵝肝不同,而油酸沒有顯著性影響,這是因?yàn)殡m然脂肪酸形成相關(guān)因子均會(huì)促進(jìn)TG沉積,引起細(xì)胞變形,但并非所有因子對(duì)同一基因調(diào)控結(jié)果一致[22]。

    在鵝肥肝生成過程中,脂肪酸合成通路中的功能蛋白,如乙酰輔酶羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、超長鏈脂肪酸延伸蛋白6(ELOVL6)等在TG在肝中快速沉積后,mRNA的表達(dá)水平均出現(xiàn)一個(gè)顯著下調(diào)的過程[23]。李富原等[24]將填飼鵝與對(duì)照鵝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)352個(gè)lncRNA存在顯著差異,其中212個(gè)表達(dá)量顯著上升,且LOCl06047490與鵝肥肝的形成密切相關(guān),受高葡萄糖、胰島素和不飽和脂肪酸的誘導(dǎo)[25]。鵝肝形成過程中涉及脂肪酸氧化、TG合成、炎癥和凋亡等方面。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同濃度棕櫚酸處理下,CPT1、 ELOVL6、DGAT2、PPARα和IL-6 表達(dá)水平變化趨勢與lnc-005028存在差異性,唯有caspase-3表現(xiàn)出一致性。蛋白水解酶的激活是凋亡程序的一個(gè)特征,包括ced-3/ICE家族中的某些胱氨酸蛋白酶,而caspase-3是胱氨酸蛋白酶的ced-3/ICE家族成員,參與通過B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)家族誘導(dǎo)的凋亡途徑,caspase-3抑制劑可降低MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26]。此外,caspase-3參與了HIV-Env介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[27],是HIV-gp41介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中活性氧(ROS)生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[28]。lnc-005028受飽和脂肪酸調(diào)節(jié),與棕櫚酸影響的caspase-3表達(dá)一致。以上結(jié)果提示lnc-005028可能通過凋亡途徑參與鵝原代肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝,但其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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