血液氨基酸濃度與IVF-ET周期妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析

李萍萍，初國銘，譚季春*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，沈陽 110022；2.遼寧省生殖障礙疾病與生育力重塑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110022；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科，沈陽 110004)

隨著醫(yī)學(xué)研究和技術(shù)的不斷進(jìn)步，輔助生殖技術(shù)(ART)已成為治療不孕癥的主要方法[1]。2016年，我國實(shí)施的IVF周期超過90萬個(gè)，分娩新生兒30萬例[2]。越來越多的不孕癥患者期待通過ART治療獲得妊娠，然而仍有一部分患者的IVF周期結(jié)局并不理想。探索相關(guān)影響因素對于預(yù)測IVF治療結(jié)局或給予相應(yīng)的干預(yù)措施具有重要的指導(dǎo)意義。影響IVF周期生殖結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)因素是多方面的。英國國家健康護(hù)理優(yōu)化研究院(The National Institute for Health and Care Excellence，NICE)臨床指南推薦將女性年齡、既往ART治療次數(shù)、既往妊娠史、體重指數(shù)和生活方式因素用于預(yù)測IVF結(jié)局，還提出胚胎移植數(shù)量、卵巢儲(chǔ)備(抗苗勒管激素水平、竇卵泡數(shù)、FSH水平等)、不孕年限、不孕原因、獲卵數(shù)和可移植胚胎數(shù)對預(yù)測IVF結(jié)局也有重要的價(jià)值[3]。近年來，一些其它影響因素如空氣污染物[4]、炎癥因素[5-6]、生殖道菌群[7]等相繼被發(fā)現(xiàn)與IVF結(jié)局密切相關(guān)。

已有研究顯示，IVF周期妊娠組與未妊娠組胚胎培養(yǎng)基中的氨基酸水平存在顯著差異，胚胎培養(yǎng)第3天的培養(yǎng)基中丙氨酸水平與胚胎移植后妊娠結(jié)局負(fù)相關(guān)[8-9]；而妊娠并發(fā)癥(妊娠期糖尿病或妊娠期高血壓)女性血液氨基酸代謝水平也發(fā)生了顯著改變[10]，提示氨基酸代謝與妊娠相關(guān)的胚胎發(fā)育和母體健康息息相關(guān)。本研究擬通過對本中心不孕癥患者IVF-ET后驗(yàn)孕日的血液氨基酸代謝組學(xué)進(jìn)行分析，以明確影響IVF結(jié)局的氨基酸種類，為IVF的治療和結(jié)局預(yù)測提供參考。

資料和方法

一、研究對象

選擇2020年4月至2020年8月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET治療、并參與中國人群輔助生殖人口及子代隊(duì)列建立與應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目的100例患者作為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：IVF-ET周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：驗(yàn)孕日未在本中心留取外周血樣。本研究通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(倫理批號2017PS269K)；所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)胚胎移植后約2周(驗(yàn)孕日，第11～15天)進(jìn)行血β-HCG測定的驗(yàn)孕結(jié)果和移植后28～35 d超聲驗(yàn)孕結(jié)果，將患者分為妊娠組(β-HCG≥2.90 U/L，且超聲顯示妊娠囊和妊娠囊內(nèi)見胎心、胎芽)和未妊娠組(β-HCG<2.90 U/L或超聲未見妊娠囊、胎心、胎芽)。

2.氨基酸代謝組學(xué)分析：通過液相色譜-串聯(lián)色譜技術(shù)(Liquid chromatography tandem chromatography，LC-MS/MS)檢測18種血液氨基酸的濃度，干血濾紙片經(jīng)含氨基酸內(nèi)標(biāo)的甲醇萃取，鹽酸正丁醇衍生后，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，質(zhì)控標(biāo)本采用美國疾控中心提供的標(biāo)準(zhǔn)濾紙片，利用已知內(nèi)標(biāo)的濃度計(jì)算出所測氨基酸濃度。進(jìn)一步將與妊娠結(jié)局相關(guān)的氨基酸按濃度高低進(jìn)行分組分析，同時(shí)分析妊娠組患者血β-HCG水平與氨基酸濃度的相關(guān)性。

3.促排卵及IVF-ET：所有患者的控制性促排卵方案及IVF-ET均按照本中心常規(guī)治療及操作規(guī)程進(jìn)行。

4.觀察指標(biāo)：收集所有患者的一般資料，包括年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、周期數(shù)、HCG日/轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、不孕病因、周期類型、促排卵方案、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植的胚胎數(shù)量和胚胎質(zhì)量、血β-HCG水平等數(shù)據(jù)。卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎的定義為8～10細(xì)胞I級或II級的D3～D4胚胎，囊胚期優(yōu)質(zhì)胚胎定義為Gardner囊胚評分AA/AB/BA/BB的胚胎。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料

本研究共納入100例IVF-ET助孕治療的不孕癥患者，根據(jù)妊娠結(jié)局將患者分為妊娠組(63例)和未妊娠組(37例)。兩組患者間年齡、基礎(chǔ)FSH值、AMH水平、移植胚胎數(shù)和胚胎類型均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，妊娠組患者的年齡更小、基礎(chǔ)FSH水平更低、AMH水平更高、移植胚胎數(shù)更少、HCG日/轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度更厚、囊胚移植比例更高；兩組患者間BMI、不孕年限、促排卵方案、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植胚胎質(zhì)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者血液氨基酸濃度比較

妊娠組患者血液中瓜氨酸的濃度顯著低于未妊娠組，而谷氨酰胺和絲氨酸的濃度顯著高于未妊娠組(P<0.05)，其它氨基酸濃度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。由于妊娠組囊胚移植比例高，因此進(jìn)一步將所有患者分為卵裂期胚胎移植組和囊胚移植組，分析兩個(gè)亞組患者氨基酸水平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)亞組患者間血液氨基酸濃度均無顯著差異(P>0.05)。

表2 患者血液氨基酸濃度(μmol/L)比較(M[P25，P75])

三、血液氨基酸濃度與妊娠結(jié)局之間的相關(guān)性

單因素Logistic回歸分析表明，血液瓜氨酸濃度越低、谷氨酰胺和絲氨酸濃度越高，妊娠的概率越高(P<0.05)。在校正了年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH水平、AMH值、移植的胚胎數(shù)量、HCG日/轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、不孕病因和移植胚胎類型等混雜因素后，多因素Logistic回歸分析表明，瓜氨酸濃度仍與妊娠呈負(fù)相關(guān)，而絲氨酸濃度與妊娠呈正相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表3 血液氨基酸濃度與妊娠結(jié)局的Logistic回歸分析

進(jìn)一步根據(jù)血液瓜氨酸和絲氨酸濃度三分位分組后，分析氨基酸濃度與妊娠結(jié)局的相關(guān)性。結(jié)果表明：與低濃度組相比，瓜氨酸高濃度組獲得臨床妊娠的概率降低71.9%；而絲氨酸中等濃度組獲得臨床妊娠的概率是低濃度組的2.65倍，高濃度組獲得臨床妊娠的概率是低濃度組的2.415倍(表4)。

表4 血液瓜氨酸和絲氨酸濃度分組與妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析

由于妊娠組與未妊娠組血液β-HCG水平具有顯著差異，我們初步分析了妊娠組患者血液β-HCG水平與不同氨基酸濃度的相關(guān)性。線性回歸分析表明，血液β-HCG水平與丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸濃度負(fù)相關(guān)，與精氨酸濃度正相關(guān)(P<0.05)；在校正了混雜因素后，多元回歸分析表明血液β-HCG水平與丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸濃度負(fù)相關(guān)，與精氨酸濃度正相關(guān)(P<0.05)(表5)。

表5 血液氨基酸濃度與臨床妊娠患者血β-HCG值相關(guān)性分析

進(jìn)一步將妊娠組患者根據(jù)血液β-HCG水平三分位分組，分成低[24.00～658.94 U/L)、中[658.95～1 918.67 U/L)、高[1 918.68～4 264.00 U/L)3個(gè)水平組，分析β-HCG水平與氨基酸濃度的相關(guān)性。結(jié)果表明：高水平β-HCG和低水平β-HCG患者血液丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸和谷氨酸濃度均無顯著差異(P>0.05)；與β-HCG中水平組相比，β-HCG低水平組丙氨酸、谷氨酸濃度均顯著升高(P<0.05)(表6)。

表6 臨床妊娠患者血液β-HCG水平與氨基酸濃度的相關(guān)性分析

討 論

氨基酸對胎兒生長非常重要，而母體血液氨基酸的濃度是影響胎兒氨基酸供應(yīng)的重要因素之一，當(dāng)胎兒氨基酸供應(yīng)中斷可能導(dǎo)致胎兒生長受限或巨大兒。一項(xiàng)薈萃分析表明，補(bǔ)充精氨酸家族的氨基酸可改善合并妊娠疾病有妊娠并發(fā)癥孕婦的胎兒出生體重，降低高危人群分娩小于胎齡兒的風(fēng)險(xiǎn)[11]。代謝組學(xué)檢測可以反映生物體、器官和細(xì)胞的內(nèi)在或外在相互作用，胚胎培養(yǎng)液的氨基酸代謝作為評價(jià)胚胎發(fā)育和預(yù)測妊娠結(jié)局的參考指標(biāo)，已經(jīng)越來越多地見諸于輔助生殖領(lǐng)域研究中。研究者發(fā)現(xiàn)在校正其它混雜因素后，胚胎培養(yǎng)液中甘氨酸和丙氨酸濃度仍與妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，提示兩者與胚胎活力有關(guān)[8]。通過數(shù)學(xué)建模表明，絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸和丙氨酸的氨基酸色譜圖峰高和峰面積組合對于妊娠組和非妊娠組的預(yù)測率分別達(dá)到82.7%和95.7%[12]。卵泡液的氨基酸代謝組學(xué)變化也可為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者提供診斷依據(jù)和治療靶點(diǎn)[13]。已發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血液賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸顯著增加，這些氨基酸代謝物的改變可能與過度炎癥反應(yīng)和血管功能障礙有關(guān)，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性差[14]。然而，血液氨基酸譜的變化如何影響IVF妊娠結(jié)局尚未確定。本研究結(jié)果提示女性血液中瓜氨酸的濃度與IVF妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，絲氨酸的濃度與IVF妊娠結(jié)局呈正相關(guān)。

瓜氨酸是一種非必需氨基酸，由小腸中的谷氨酰胺和脯氨酸內(nèi)源性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。瓜氨酸在腎臟中被吸收并轉(zhuǎn)化為精氨酸，然后釋放到全身血液中[15]。在瓜氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸的過程中，一氧化氮合酶介導(dǎo)了血管擴(kuò)張劑一氧化氮的生成。正常妊娠過程中，由子宮動(dòng)脈內(nèi)皮合成的一氧化氮可增加通過動(dòng)脈的血流量，以滿足胎兒日益增長的營養(yǎng)需求。妊娠期過量飲酒可影響瓜氨酸生物合成和代謝相關(guān)的特定途徑，可能是酒精誘導(dǎo)的子宮動(dòng)脈功能障礙的潛在機(jī)制[16]。我們推測在胚胎植入階段，較低濃度的母體瓜氨酸可能通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的血流影響胚胎的著床過程。絲氨酸也是一種非必需氨基酸，是糖酵解途徑的中間產(chǎn)物。絲氨酸具有多種有益作用，它是大腦功能和發(fā)育的重要營養(yǎng)素，能促進(jìn)神經(jīng)元的生長[17]。一項(xiàng)隨訪4年的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，血液絲氨酸水平與代謝綜合征的發(fā)展和血脂異常呈負(fù)相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸具有有益妊娠的作用，與這些前期報(bào)道相符。一項(xiàng)針對反復(fù)種植失敗女性的血液代謝物分析亦發(fā)現(xiàn)精氨酸代謝途徑受損[19]，提示我們有必要深入探索精氨酸代謝途徑調(diào)控胚胎植入的具體分子機(jī)制，從而為一些不明原因妊娠失敗患者提供新的治療靶點(diǎn)。

此外，本研究尚存在一些不足之處，有待未來在大樣本研究中進(jìn)一步改進(jìn)：(1)本研究納入的對象為所有的驗(yàn)孕患者，應(yīng)設(shè)立嚴(yán)格的排除標(biāo)準(zhǔn)，保證研究人群的均一性，從而明確影響血液氨基酸水平的相關(guān)因素；(2)研究的樣本量較小，無法得出瓜氨酸或絲氨酸濃度作為預(yù)測IVF妊娠結(jié)局的臨界值。