超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)的影響研究

張盼盼，張麗芬，2，潘潤(rùn)森，陳復(fù)生*，賴(lài)少娟

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052；2.河南省南街村（集團(tuán)）有限公司，河南漯河462600）

櫻桃番茄又稱(chēng)圣女果、小番茄，因果實(shí)口味酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞。櫻桃番茄富含維生素C 和酚類(lèi)化合物等活性成分，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗癌和減緩心血管病的作用。櫻桃番茄采摘后，果實(shí)的呼吸作用產(chǎn)生活性氧，激活苯丙氨酸解氨酶基因，促進(jìn)了果實(shí)中酚類(lèi)化合物生物合成。但是，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，在氧化酶與活性氧作用下，維生素C和酚類(lèi)化合物被消耗，含量下降[1-2]。因此，采用貯藏保鮮技術(shù)保持櫻桃番茄果蔬營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值具有重要意義。

超聲具有高效、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在采后果蔬保鮮中。研究發(fā)現(xiàn)，由于水的超聲分解而形成的自由基對(duì)植物細(xì)胞系統(tǒng)施加氧化應(yīng)激，并誘導(dǎo)更高的苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，苯丙烷代謝增強(qiáng)，使果蔬中酚類(lèi)物質(zhì)含量增加[3]。此外，超聲處理能夠抑制果蔬中維生素C 含量的降低，并提高果實(shí)抗氧化能力[4]。超聲與浸漬保鮮聯(lián)合使用，在維持果蔬品質(zhì)特性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。常用的浸漬液有鈣溶液，鈣（Ca2+）在調(diào)節(jié)果蔬采后生理功能過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。研究表明，鈣作為分子間結(jié)合劑，有助于維持果蔬硬度以及細(xì)胞膜穩(wěn)定性[5]。

因此，本文以櫻桃番茄為原料，研究超聲協(xié)同鈣浸漬處理對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)和抗氧化能力的影響，通過(guò)對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性分析，揭示超聲協(xié)同鈣浸漬提高櫻桃番茄品質(zhì)機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

櫻桃番茄，品種“圣女1416”，采摘于河南省安陽(yáng)市種植園。

乳酸鈣（食品級(jí)）：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；甲酸、乙醇、乙腈（色譜級(jí)）：美國(guó)CBS 公司；沒(méi)食子酸、綠原酸、蘆丁、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸（色譜級(jí)）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫超聲波清洗機(jī)（SBL-10DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)（GL-10000C）：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；高效液相色譜儀（Waters 1525 Binary Pump）：美國(guó)Waters 公司；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Esquire LC）：德國(guó)Bruker 公司。

1.3 樣品處理

櫻桃番茄采摘后立即送往實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻、成熟度相似的果實(shí)分組進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)共分為4組：對(duì)照組（CK 組，未處理的新鮮果實(shí)）；超聲組（U 組，20 W/L、15 ℃、15 min）；鈣浸漬組（Ca 組，2%乳酸鈣、15 ℃、15 min）和超聲協(xié)同鈣浸漬組（U+Ca 組，20 W/L、2%乳酸鈣、15 ℃、15 min）。處理后的樣品裝入帶孔保鮮盒，置于4 ℃環(huán)境中貯藏。

1.4 總酚

總酚測(cè)定參照Toor R K 等[6]方法。

1.5 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

取20 mg 冷凍干燥后的總酚樣品，溶于1 mL 流動(dòng)相中（甲酸∶水=0.8∶99.2，體積比），樣品過(guò)0.22 μm 濾膜，進(jìn)樣量為20 μL。

色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 色譜柱，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，流動(dòng)相A（甲酸-水，0.8∶99.2，體積比），流動(dòng)相B（乙腈，100%），紫外檢測(cè)器在280 nm 和330 nm 處進(jìn)行檢測(cè)。梯度洗脫程序：0～10 min，5%B；10.01 min～25 min，15%B；25.01 min～40 min，20%B；40.01min～42min，40%B；42.01 min～50 min，0%B。

1.6 抗氧化能力

1，1-二苯基-2-吡啶并肼基自由基清除能力（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH） 測(cè)定參照Pataro G 等[7]方法。

1.7 酶活測(cè)定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測(cè)定參照Luh B S 等[8]方法。

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性測(cè)定參照Z(yǔ)hao R 等[9]方法。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性測(cè)定參照Yingsanga P 等[10]方法。

1.8 液質(zhì)聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析

酚類(lèi)提取液經(jīng)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂純化后進(jìn)行濃縮，凍干。凍干后的酚類(lèi)樣品過(guò)0.22 μm 濾膜，進(jìn)樣量為20 μL。

色譜條件：同1.5（色譜柱Zorbax SB-C18）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI），離子源噴霧電壓為4.5 kV，毛細(xì)管溫度200°C，霧化器氮?dú)? psi（1 psi=6.895 kPa），干燥氮?dú)饬魉?0 L/min，掃描范圍為m/z 50～1 000，負(fù)離子模式掃描。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010，SPSS 20 和GraphPad Prism 5 進(jìn)行處理，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄中酚類(lèi)含量的影響

櫻桃番茄酚酸高效液相色譜（HPLC）結(jié)果見(jiàn)圖1。

酚類(lèi)物質(zhì)是果蔬組織重要的次生代謝產(chǎn)物，HPLC分析結(jié)果顯示櫻桃番茄中含有沒(méi)食子酸、槲皮素、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、丁香酸和阿魏酸，其中沒(méi)食子酸、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸和阿魏酸為主要酚酸。

圖1 櫻桃番茄酚酸色譜圖Fig.1 The chromatogram of phenolic acid in cherry tomatoes

超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚類(lèi)含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)含量的影響Fig.2 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on phenolics content of cherry tomatoes during storage

如圖2（a）所示，貯藏過(guò)程中，櫻桃番茄中總酚含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，并在第15 天達(dá)到最低值。貯藏10 d ～15 d，Ca 組和U+Ca 組的總酚含量顯著高于CK 組，超聲作用增強(qiáng)苯丙烷代謝，促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)的增加，同時(shí)鈣浸漬延緩了酚類(lèi)物質(zhì)的消耗[3]。因此，超聲協(xié)同鈣浸漬技術(shù)具備維持較高總酚含量的作用。

超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中沒(méi)食子酸、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸和阿魏酸含量的影響如圖2（b～e）所示，沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸和阿魏酸含量總體呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且在15 d 達(dá)到最高值，此時(shí)U+Ca 組各酚酸含量（26.64、1.70、1.22 μg/g）均顯著高于CK（22.59、1.08、0.78 μg/g）組。沒(méi)食子酸和對(duì)羥基苯甲酸含量在貯藏第0 天～第5 天呈下降趨勢(shì)，可能與果實(shí)消耗對(duì)羥基苯甲酸以抵御低溫逆境有關(guān)。綠原酸含量在貯藏第5 天達(dá)到最高值，此時(shí)U+Ca 組（3.97 μg/g）含量顯著高于CK 組（3.53 μg/g）。貯藏末期（30 d），U+Ca 組對(duì)羥基苯甲酸和阿魏酸含量（0.77 μg/g 和0.53 μg/g）顯著高于CK 組（0.41 μg/g 和0.23 μg/g）。結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬處理能夠有效延緩酚酸含量的降低。

2.2 超聲波協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚類(lèi)抗氧化能力的影響

超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚類(lèi)抗氧化能力的影響如圖3 所示。

由圖3 可知，櫻桃番茄貯藏期間抗氧化能力呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，與總酚含量變化相一致。果實(shí)中較高的酚類(lèi)物質(zhì)含量能夠提供更多的基團(tuán)參與到與自由基的反應(yīng)中，提供更高的抗氧化能力[11-12]。整個(gè)貯藏期間，U+Ca 組DPPH 自由基清除率均顯著高于CK 組，且在貯藏15 d 以后，U+Ca 組DPPH 自由基清除率顯著高于Ca 組，表明超聲協(xié)同鈣浸漬處理能夠有效保持櫻桃番茄貯藏期間較高的抗氧化能力。

圖3 超聲波協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚類(lèi)抗氧化能力的影響Fig.3 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on the antioxidant capacity of phenols of cherry tomatoes during storage

2.3 超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酶活的影響

超聲協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酶活的影響研究見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，貯藏過(guò)程中，櫻桃番茄PPO 和POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在貯藏第15 天達(dá)到最大值，與總酚含量變化趨勢(shì)一致。貯藏末期（30 d），U+Ca 組的PPO 和POD 活性[338.33 ΔOD420nm/（min·g）和180.00 ΔOD470nm/（min·g）] 顯著低于CK 組[（379.00 ΔOD420nm/（min·g）和207.73 ΔOD470nm/（min·g）]。較低的PPO 和POD 活性可減少酚類(lèi)物質(zhì)的消耗，延緩酚類(lèi)物質(zhì)含量的下降[12-13]。因此，U+Ca 處理能夠顯著抑制貯藏期間PPO 和POD 活性。

圖4 超聲波協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酶活性的影響Fig.4 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on the enzyme activity of cherry tomatoes during storage

櫻桃番茄PAL 酶活隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在貯藏第20 天達(dá)到最大值，這可能與次級(jí)代謝產(chǎn)物如酚類(lèi)物質(zhì)的積累不相同有關(guān)。貯藏末期（30 d），U+Ca 組的PAL 活性[252.40 ΔOD290nm/（h·g）]顯著低于CK 組和U 組[（303.87、313.20 ΔOD290nm/（h·g）]，表明U+Ca 處理有效抑制苯丙烷類(lèi)代謝系統(tǒng)，減少次級(jí)代謝產(chǎn)物（酚類(lèi)物質(zhì)）的生產(chǎn)，延緩果實(shí)成熟與衰老[14-15]。

2.4 超聲波協(xié)同鈣浸漬對(duì)櫻桃番茄貯藏過(guò)程中酚酸結(jié)構(gòu)特性的影響

以貯藏30 d 的櫻桃番茄進(jìn)行HPLC-MS 分析，根據(jù)櫻桃番茄負(fù)離子模式下主要化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)照，已鑒別的化合物的質(zhì)荷比（m/z）以及保留時(shí)間結(jié)果見(jiàn)圖5，酚酸保留時(shí)間及質(zhì)譜特征見(jiàn)表1[16-18]。

圖5 櫻桃番茄酚酸質(zhì)譜圖Fig.5 The mass spectrum of phenolic acids of cherry tomato

表1 櫻桃番茄酚酸保留時(shí)間及質(zhì)譜特征Table 1 Cherry tomato phenolic acids retention time and mass spectrum characteristics

續(xù)表1 櫻桃番茄酚酸保留時(shí)間及質(zhì)譜特征Continue table 1 Cherry tomato phenolic acids retention time and mass spectrum characteristics

新鮮櫻桃番茄中共鑒別出8 種化合物，分別為5-沒(méi)食子酸奎寧酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C，但仍有大量化合物未鑒別出。其中，綠原酸、隱綠原酸為同分異構(gòu)體，異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 為同分異構(gòu)體。櫻桃番茄中出現(xiàn)隱綠原酸是由于綠原酸類(lèi)成分結(jié)構(gòu)母核相同，在一定條件下可以通過(guò)分子內(nèi)酯基遷移發(fā)生異構(gòu)化[16]。貯藏第30 天，CK 組櫻桃番茄主要酚酸是咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異綠原酸A；U 組櫻桃番茄主要酚酸是阿魏酸、綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 和異綠原酸C；Ca 組櫻桃番茄主要酚酸是對(duì)香豆酸/綠原酸、表沒(méi)食子酸兒茶素、蘆丁和異綠原酸A；U+Ca 組櫻桃番茄主要酚酸是咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 和異綠原酸C?，F(xiàn)有結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隱綠原酸存在于CK 組櫻桃番茄中，可能是由于貯藏第30 天CK 組果實(shí)的pH 值更接近中性，使得綠原酸更易轉(zhuǎn)化為隱綠原酸[17-18]。結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬能夠有效抑制貯藏期間櫻桃番茄主要酚酸的消耗，維持酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性。

3 結(jié)論

與對(duì)照組相比，超聲協(xié)同鈣浸漬處理有效延緩了櫻桃番茄貯藏過(guò)程中總酚含量下降。此外，貯藏末期PPO、POD、PAL 活性[338.33 ΔOD420nm/（min·g）、180.00 ΔOD470nm/（min·g）和252.40 ΔOD290nm/（h·g）]顯著低于CK 組[379.00 ΔOD420nm/（min·g）、207.73 ΔOD470nm/（min·g）和303.87 ΔOD290nm/（h·g）]，表明超聲協(xié)同鈣浸漬技術(shù)顯著抑制貯藏過(guò)程中PPO、POD 和PAL 酶活性。質(zhì)譜結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬處理有效延緩櫻桃番茄酚酸消耗，維持櫻桃番茄酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性與抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲協(xié)同鈣浸漬處理有效抑制櫻桃番茄貯藏期間多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性，維持較高抗氧化活性和酚類(lèi)物質(zhì)含量，延緩果實(shí)衰老。