CXCL8和MSMO1基因在宮頸鱗癌預(yù)后評價中的臨床價值

郭思慧，向雪萍，匡婷，康佳文，陳曉艷，符曉華，張勇，李樂賽

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計，估計有60.4萬宮頸癌新發(fā)病例和34.2萬死亡病例，宮頸癌是導(dǎo)致女性死亡的第4大惡性腫瘤，尤其在發(fā)展中國家，宮頸癌是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。在主要的組織學(xué)類型中，宮頸鱗癌占宮頸癌75%～80%，臨床上宮頸鱗癌患者通過治療取得一定療效[2]，但仍有35%患者在初次治療后發(fā)生復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移/未控而導(dǎo)致預(yù)后差[3]。盡管可通過國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期和腫瘤病理特征反映患者嚴重程度并判斷患者預(yù)后，但準確率不高[4]，研究人員積極探索評估宮頸鱗癌預(yù)后的生物標志物，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和p53等。但目前臨床尚無公認的用于評估預(yù)后的分子標志物。

本研究通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)C-X-C基因序趨化因子配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和和甲基固醇單加氧酶 1（methylsterol monooxygenase 1，MSMO1）與宮頸鱗癌預(yù)后相關(guān)，并通過實時熒光定量PCR法驗證CXCL8和MSMO1基因在宮頸鱗癌細胞中高表達以及CCK-8法檢測MSMO1基因?qū)m頸鱗癌細胞的增殖影響，為尋找宮頸鱗癌患者預(yù)后相關(guān)的生物標志物提供進一步的研究思路和線索。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

宮頸鱗癌細胞系Siha以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）HUVE-12購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自以色列Bioind公司，Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；CXCL8基因、MSMO1基因、內(nèi)參照GAPDH基因引物和攜帶特異性針對MSMO1基因的siRNA以及陰性對照（negative control，NC）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

細胞培養(yǎng)箱（3110型）為美國Thermo Electron公司產(chǎn)品，倒置光學(xué)顯微鏡（CX41型）為日本Olympus公司產(chǎn)品，電泳儀、PCR儀（CFX96 Touch型）和免疫酶標檢測儀（Synergy型）均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，凝膠成像儀（TANON-5000型）為上海天能科技公司產(chǎn)品。

1.2 微陣列數(shù)據(jù)

在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）GEO數(shù)據(jù)庫檢索宮頸鱗癌相關(guān)基因芯片。檢索詞為“（cervical）or（cervix）”和“（cancer）or（tumor）”，限制研究類型為Expression profiling by array，限制種屬為Homo sapiens。納入標準：數(shù)據(jù)集包含正常對照（normal）和宮頸鱗癌（cancer）；Affymetrix基因表達譜芯片，平臺為GPL96。

最終納入2個數(shù)據(jù)集GSE7803和GSE9750。GSE7803包含10個正常樣本和21個宮頸鱗癌樣本[5]。GSE9750包含24個正常樣本和33個宮頸鱗癌樣本[6]。使用R軟件ggpubr和ggthemes包對2個數(shù)據(jù)集進行主成分分析（principal component analysis，PCA）以及ggplot2包繪制火山圖展示差異表達基因分析結(jié)果。在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載304例宮頸鱗癌樣本和3例正常樣本相應(yīng)的臨床資料。本研究流程圖如圖1所示。

1.3 差異表達基因篩選及分析

利用GEO2R篩選差異表達基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）。差異表達基因的篩選標準為P＜0.05且|Log2FC|≥1（fold change，F(xiàn)C）。通過venn圖篩選2組數(shù)據(jù)集重疊的差異表達基因。利用DAVID（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）對差異表達基因進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO分析包括生物過程、細胞組成和分子功能3個部分，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過STRING揭示差異基因編碼蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用cytoscape軟件的cytohubba插件篩選關(guān)鍵基因。采用Cytohubba計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的11種拓撲分析方法，選取每種方法分數(shù)排名前10的基因，組成Hub基因集。

1.4 Hub基因分析

利用基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫分析Hub基因在正常組織和宮頸鱗癌中的表達水平以及預(yù)后關(guān)系。利用人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（human protein atlas，HPA）分析Hub基因在正常宮頸組織和宮頸癌中的蛋白表達水平。使用R語言軟件分析TCGA宮頸鱗癌臨床數(shù)據(jù)中Hub基因?qū)颊叩念A(yù)后價值。對Hub基因進行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），進一步探索基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系及基因功能和意義。

1.5 單因素和多因素COX風(fēng)險回歸模型分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載304例宮頸鱗癌基因表達譜數(shù)據(jù)和臨床資料，分別取CXCL8和MSMO1表達量的截斷值分為高表達組和低表達組。用χ2檢驗分析CXCL8和MSMO1表達與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，單因素和多因素COX風(fēng)險回歸模型檢驗預(yù)后相關(guān)因素。

1.6 隨機森林模型構(gòu)建及驗證

通過構(gòu)建隨機森林模型來預(yù)測患者預(yù)后。采用R軟件讀取CXCL8和MSMO1基因表達數(shù)據(jù)集及TCGA臨床樣本數(shù)據(jù)304例。使用隨機函數(shù)，將基因表達數(shù)據(jù)集按1∶1隨機分為訓(xùn)練組和驗證組，用于隨機森林模型的構(gòu)建和驗證。調(diào)用randomForest包構(gòu)建隨機森林模型，計算CXCL8和MSMO1基因的重要程度，其中參數(shù)ntree＝500表示使用500棵決策樹模型用于隨機森林的分類。應(yīng)用predict和ggboxplot函數(shù)將訓(xùn)練組和驗證組的數(shù)據(jù)納入構(gòu)建的隨機森林模型中，計算預(yù)測值并繪制箱型圖。應(yīng)用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）和曲線下面積（area under curve，AUC）評估預(yù)測模型的準確性。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測Siha細胞中CXCL8和MSMO1 mRNA的表達水平

收集細胞，用TRIzol試劑提取細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，加入引物以及適量cDNA，以GAPDH基因作為內(nèi)參照，進行PCR擴增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s、95 ℃變性10 s、63 ℃退火30 s、返回95 ℃ 10 s，共39個循環(huán)；65～95 ℃，每0.5 ℃5 s梯度遞增；終止反應(yīng)。以2-△△Ct值表示目的基因mRNA的表達量。實驗獨立重復(fù)3次。實驗組為宮頸鱗癌Siha細胞，對照組為HUVE-12細胞。

CXCL8基因上游引物序列為5’-AACTGAG AGTGATTGAGAGTGG-3’，下游引物序列為5’-ATGAATTCTCAGCCCTCTTCAA-3’；MSMO1基因上游引物序列為5’-GTTCATCA TGAGTTTCAGGCTC-3'，下游引物序列為5’-TACATGATCACACAAAAGCACG-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-CTGCCAAC GTGTCAGTGGTG-3’，下游引物序列為5’-TC AGTGTAGCCCAGGATGCC-3’。

1.8 細胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將特異性針對MSMO1基因的siRNA（siMSMO1）瞬時轉(zhuǎn)入人宮頸鱗癌Siha細胞，轉(zhuǎn)染流程參閱試劑盒來源公司提供的操作流程。實驗分為對照組（siNC）、siMSMO1-1組、siMSMO1-2組和siMSMO1-3組。轉(zhuǎn)入siMSMO148h后，采用實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率，實驗流程同1.7節(jié)。siMSMO1-1正義鏈序列為5’-GCAUAGACUCUUACACCACAATT-3’，反義序列鏈為5’-UUGUGGUGUAAGAGUCUA UGCTT-3’；siMSMO1-2正義鏈序列為5’-CU CUCAGUAUAAUGCCUAUAATT-3’，反義鏈序列為5’-UUAUAGGCAUUAUACUGAGAGTT；siMSMO1-3正義鏈序列為5’-AUGGGUGACC AUUCGUUUAUUTT-3’，正義鏈序列為5’-AAUAAACGAAUGGUCACCCAUTT-3’；siNC正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACA CGUUCGGAGAATT-3’。

1.9 CCK-8法檢測

分別于siNC、siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3轉(zhuǎn)入Siha細胞24、48和72 h時，加入含10% CCK-8溶液的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm處檢測各孔的D值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計分析采用R（4.0）和GraghPad Prism 8進行。利用R軟件獲得各基因的最佳截斷值和生存曲線。用χ2檢驗分析Hub基因表達與宮頸鱗癌臨床因素的相關(guān)性。進行單因素和多因素COX風(fēng)險回歸分析模型選擇獨立預(yù)后因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選

對GSE7803（圖2A）和GSE9750（圖2B）數(shù)據(jù)集進行PCA分析，結(jié)果顯示2組數(shù)據(jù)集的樣品組間差異明顯，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量好，可進行下一步差異分析。

GSE7803數(shù)據(jù)集中共有878個差異表達的基因，其中有488個為表達上調(diào)的基因，390個為表達下調(diào)的基因（圖2C）；GSE9750數(shù)據(jù)集共有2 470個差異基因，其中有548個為表達上調(diào)的基因，1 922個為表達下調(diào)的基因（圖2D）。利用venn圖分別將2組數(shù)據(jù)集的上、下調(diào)差異基因取交集，獲得上調(diào)差異基因集和下調(diào)差異基因集，篩選出表達上調(diào)的基因245個，表達下調(diào)的基因334個，結(jié)果如圖2E和圖2F所示。

2.2 GO和KEGG通路富集分析

GO分析結(jié)果（圖3）顯示，差異表達基因主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細胞復(fù)制、細胞分裂和細胞增殖等生物過程。差異表達基因的細胞組成包括外泌體、細胞質(zhì)、細胞核、核漿和細胞膜等。在分子功能方面，差異表達基因主要富集于蛋白結(jié)合、染色體結(jié)合、染色體二聚體化和同蛋白結(jié)合等。KEGG分析結(jié)果（表1）顯示，差異表達基因主要富集在腫瘤、細胞周期、人類嗜T細胞病毒類型Ⅰ（human T-cell leukemia virus type-Ⅰ，HTLV-Ⅰ）感染和腫瘤中的微RNA（microRNA，miRNA）等10條通路中。GO和KEGG分析結(jié)果表明，細胞增殖和分裂的變化在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展進程中扮演重要角色。

表1 前10差異基因KEGG富集通路Table 1 Top 10 differential gene kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) enrichment pathway

Fig.2 Principal component analysis (PCA) analysis graph of GSE7803 and GSE9750 data sets (A-B),the volcano diagram (B-C) and venn diagram (E-F) with up-regulated differential genes and the volcano diagram and venn diagram with down-regulated differentially expressed genes.圖2 GSE7803和GSE9750數(shù)據(jù)集的PCA分析圖（A和B）、上調(diào)和下調(diào)差異基因的火山圖（C和D）以及venn圖（E和F）

Fig.3 Gene ontology (GO) analysis of Hub genes:biological process (A),cell composition (B) and molecular function (C).圖3 差異表達基因GO分析結(jié)果生物過程（A）、細胞組成（B）和分子功能（C）

2.3 蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）分析和關(guān)鍵基因篩選

通過Cytohubba插件的11種計算方法，篩選出58個關(guān)鍵基因。關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖4所示。GEPIA在線工具分析結(jié)果顯示，其中10個關(guān)鍵基因在宮頸鱗癌中的表達與患者的預(yù)后顯著相關(guān)；其中CXCL8（P＝3.4×10-5）、MSMO1（P＝4.6×10-3）、拓撲異構(gòu)酶Ⅱα（topoisomeraseⅡα，TOP2A）（P＝0.031）、微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance protein，MCM2）（P＝0.01）、細胞分裂周期45（cell division cycle 45，CDC45）（P＝0.038）、載脂蛋白C1（apolipoprotein C1，APOC1）（P＝0.049）、GINS復(fù)合物亞基2（GINS complex subunit 2，GINS2）（P＝0.037）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（P＝0.023）等8個基因在宮頸鱗癌中表達上調(diào)，胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）（P＝0.029）和Jun原癌基因（Jun protooncogene，JUN）（P＝0.029）這2個基因在宮頸鱗癌中表達下調(diào)。

Fig.4 Protein-protein interaction network (PPI) of hub genes.圖4 Hub基因的PPI

生存分析結(jié)果（圖5A）顯示，CXCL8和MSMO1基因高表達宮頸鱗癌患者的總生存期（overall survival，OS）較低表達者明顯縮短（P＝1.5×10-5和P＝0.037），提示CXCL8和MSMO1基因高表達可能與宮頸鱗癌患者的不良預(yù)后相關(guān)?；赥CGA的數(shù)據(jù)分析結(jié)果（圖5B）顯示，與正常組織比較，CXCL8和MSMO1基因在宮頸鱗癌組織中的表達明顯升高。通過HPA數(shù)據(jù)庫檢索免疫組織化學(xué)檢測標本，獲得宮頸正常組織標本3例，宮頸鱗癌標本11例；免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果（圖5C）顯示，宮頸正常組織標本中均未檢測到MSMO1蛋白的表達，宮頸鱗癌組織中2例MSMO1蛋白表達呈陽性（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000052802-MSMO1/pathology/cervical+cancer#ihc）（所有結(jié)果均已獲得原出版單位授權(quán)）。

Fig.5 Correlation between C-X-C motif chemokine ligand 8 (CXCL8) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) gene expression levels and prognosis of patients with cervical squamous carcinoma (A),CXCL8 and MSMO1 gene expression levels in normal and cervical cancer tissues (B) and MSMO1 protein expression in normal and cervical cancer tissue was detected by immunohistochemistry (DAB staining).圖5 CXCL8和MSMO1基因表達水平與宮頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性（A），CXCL8和MSMO1基因在正常組織和宮頸癌組織中的表達水平（B）以及MSMO1蛋白在正常組織和宮頸癌組織中的表達水平

2.4 CXCL8和MSMO1 mRNA表達與宮頸鱗癌臨床相關(guān)因素分析及GSEA富集分析

對304例宮頸鱗癌患者的臨床病理特征分析結(jié)果（表2）顯示，CXCL8和MSMO1表達水平與患者的年齡（P＝0.045和P＝0.013）以及OS期（P＝0.015和P＜0.001）均有明顯的相關(guān)性。

表2 CXCL8和MSMO1 mRNA表達與宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlations between the chemokine C-X-C motif ligand 8 (CXCL8) and methylsterol monooxygenase 1(MSMO1) mRNA expression and clinicopathological factors of patients with cervical squamous cancern (%)

TCGA-CESC臨床數(shù)據(jù)的單變量和多變量COX回歸分析結(jié)果（表3）顯示，腫瘤患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CXCL8和MSMO1基因的表達水平與宮頸鱗癌患者的OS相關(guān)（P均＜0.05）。GSEA富集分析結(jié)果（圖6）顯示，CXCL8基因主要富集于23條通路（P＜0.05），其中小細胞肺癌、腎細胞癌和NOD樣受體信號等通路與癌癥相關(guān)；MSMO1基因主要富集于29條通路（P＜0.05），其中，抗原處理和呈遞、細胞黏附分子、移植物抗宿主和原發(fā)性免疫缺陷等通路明顯與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

表3 影響宮頸癌OS期的單因素和多因素分析結(jié)果Table 3 The results of univariate and multifactorial analyses affecting overall survival (OS) of cervical cancer

Fig.6 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) enrichment analysis of chemokine(C-X-C motif) ligand 8(CXCL8) (A) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) gene (B).圖6 CXCL8（A）和MSMO1基因（B）的GSEA富集分析圖

2.5 隨機森林模型構(gòu)建結(jié)果

對CXCL8和MSMO1進行森林模型構(gòu)建，計算臨床數(shù)據(jù)中每個基因的重要程度，并利用varImpPlot函數(shù)進行可視化（圖7）。將訓(xùn)練組數(shù)據(jù)納入構(gòu)建好的森林模型中，結(jié)果（圖8A）顯示在生存組和死亡組中，患者的預(yù)測評分存在明顯差異（P＜0.05）。同樣的，將驗證組的臨床信息納入模型，結(jié)果同樣顯示該模型可以預(yù)測宮頸鱗癌患者的生存和死亡狀態(tài)（P＜0.05）。本模型中，訓(xùn)練組預(yù)測結(jié)果的ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）＝1.00，驗證組的AUC＝0.71，說明模型預(yù)測能力較好（圖8B）。

Fig.7 The importance of chemokine C-X-C motif chemokine ligand 8 (CXCL8) (A) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) gene in the random forest model.The horizontal axis refers to increase in node purity,the higher the value,the greater the importance of the gene,the vertical axis were the genes.圖7 隨機森林模型中CXCL8和MSMO1基因的重要性

Fig.8 Box diagram and receiver operating characteristic (ROC) curve of model verification results.A:Box plot of the prediction results of the training group and the validation group;B:ROC curve of the model in the training group and the validation group.圖8 訓(xùn)練組和驗證組的模型驗證結(jié)果[箱型圖（A）及ROC曲線（B）]

2.6 Siha細胞中CXCL8和MSMO1 mRNA高表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖9）顯示，CXCL8 mRNA在Siha細胞中的相對表達量為9.15±2.58，明顯高于HUVE-12細胞中的1.00±0.00，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MSMO1 mRNA在Siha細胞中的相對表達量為2.53±0.61，明顯高于HUVE-12細胞中的1.00±0.00，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。

Fig.9 The expression levels of C-X-C motif chemokine ligand 8 (CXCL8) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) mRNA in cervical squamous cell carcinoma Siha cells and human umbilical vein endothelial HUVE-12 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (n=3).圖9 實時熒光定量PCR法檢測MSMO1和CXCL8 mRNA在宮頸鱗癌Siha和人臍靜脈內(nèi)皮HUVE-12細胞中的表達水平

2.5 敲低MSMO1基因表達對Siha細胞增殖的影響

為了探討MSMO1基因?qū)θ藢m頸鱗癌Siha細胞增殖的影響，分別轉(zhuǎn)入siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3沉默Siha細胞中MSMO1基因的表達水平。實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果（圖10A）顯示，轉(zhuǎn)入siMSMO1 48 h后，siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3均能明顯下調(diào)MSMO1 mRNA的表達水平（P均＜0.000 1）。CCK-8法檢測結(jié)果（圖10B）顯示，采用siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3沉默MSMO1基因表達后，Siha細胞的增殖能力被明顯抑制（P＜0.05）。

Fig.10 The expression level of methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) mRNA in Siha cells transfected with siMSMO1-1,siMSMO1-2 and siMSMO1-3 were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(A).The proliferation of Siha cells were detected by CCK-8 method (B).Siha cells were transfected with siNC as the control group.**P ＜ 0.01,****P ＜ 0.000 1,vs siNC group (n=3).圖10 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)入siMSMO1對Siha細胞中MSMO1 mRNA表達水平的影響（A）并采用CCK-8法檢測沉默MSMO1基因表達對Siha細胞增殖能力的影響（B）

3 討論

宮頸癌是發(fā)展中國家最常見的婦科腫瘤。盡管應(yīng)用宮頸癌篩查和多種臨床治療手段，其臨床治療效果及預(yù)后得到改善，但仍存在一些難治或復(fù)發(fā)患者，復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移患者五年生存率僅為30%[7]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CXCL8和MSMO1基因?qū)m頸鱗癌患者預(yù)后判斷具有重要價值。

CXCL8是一種促炎癥趨化因子，在胃癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、頭頸部鱗狀細胞癌[10]和其他腫瘤中高表達，能夠刺激中性粒細胞和淋巴細胞發(fā)生顆粒釋放和氧化。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL8在宮頸鱗癌細胞和組織中過表達，且過表達CXCL8的患者預(yù)后更差。有研究報道，CXCL8過表達促進宮頸癌的生長與轉(zhuǎn)移，是宮頸癌患者預(yù)后差的獨立危險因素[11-12]，本研究結(jié)果與之相同。CXCL8與腫瘤的炎癥、免疫反應(yīng)和血管新生生成密切相關(guān)[13]。這也與本文在KEGG分析方面的結(jié)果相似，即CXCL8富集于腫瘤和趨化因子信號通路。ZHANG等[14]在體內(nèi)外研究中均發(fā)現(xiàn)，CXCL8過表達誘導(dǎo)腫瘤細胞的生長、克隆形成和血管生成。以上結(jié)果提示，CXCL8在宮頸癌中發(fā)揮促癌基因作用，其過表達是宮頸癌患者預(yù)后不良因子。目前關(guān)于CXCL8在宮頸癌中的機制研究相對全面，本文未進行后續(xù)分析，需要未來深入探討。

MSMO1編碼甲基甾醇單加氧酶1催化膽固醇合成途徑中C4-甲基固醇的去甲基化。本研究通過GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)MSMO1主要富集于類固醇合成、萜類生物合成和不飽和脂肪酸合成等通路。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，MSMO1基因涉及細胞增殖、抗原處理和呈遞、細胞黏附分子和原發(fā)性免疫缺陷等通路。既往也有研究發(fā)現(xiàn)，MSMO1在高密度脂蛋白膽固醇生物合成、能量代謝和胰島素水平異常中發(fā)揮作用[15]。在肝癌細胞中，miR-23a和miR-23b下調(diào)MSMO1導(dǎo)致肝癌糖異生、固醇和膽固醇代謝發(fā)生異常[16]。目前，僅有少量研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中膽固醇含量高于正常宮頸組織，且癌癥患者總生存率隨著血清中膽固醇濃度增高而降低[17]。為了進一步證實MSMO1在宮頸癌中的作用，本研究通過分析TCGA臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)MSMO1高表達與宮頸癌患者預(yù)后差密切相關(guān)，免疫組織化學(xué)和實時熒光定量PCR證實MSMO1在宮頸癌組織和鱗癌細胞中高表達，敲低MSMO1表達可以抑制Siha細胞的增殖能力。綜上所述，MSMO1基因在宮頸鱗癌組織和細胞中過表達可能與患者不良的臨床結(jié)局相關(guān)，MSMO1基因具有促進宮頸鱗癌Siha細胞增殖能力的作用，可能是評估宮頸鱗癌患者預(yù)后的一個新的分子標志物。對于MSMO1基因在宮頸鱗癌中的作用和功能通路未見相關(guān)報道，因此MSMO1在宮頸鱗癌中影響及作用機制有待進一步探索。

本研究存在一定的局限性。生物信息學(xué)計算方法和數(shù)據(jù)集整合方式不同，可能導(dǎo)致本結(jié)果與其他研究存在差異。另外，生物信息學(xué)分析的結(jié)果需要經(jīng)過基礎(chǔ)和臨床研究驗證才更可靠。因此，在未來的研究中將在細胞和動物實驗中進一步探索CXCL8和MSMO1基因在宮頸發(fā)生和發(fā)展的機制，同時結(jié)合臨床樣本驗證CXCL8和MSMO1基因?qū)δ[瘤患者預(yù)后的判斷作用。