血清外泌體vWF含量及活性對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的影響

葉芬，張淑賢，菅成蓮，孫嫻婷，許壁榆, ，肖菲，黃洪暉，侯健，王婷

非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin’s lymphoma，NHL）是起源于淋巴細(xì)胞或淋巴組織的一組血液系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，NHL在男、女惡性腫瘤發(fā)病率中分別位于第8和第10位[1]。而彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）則是發(fā)病率最高的B細(xì)胞NHL，占所有NHL的30%～35%[2]。DLBCL是一類高度異質(zhì)性疾病，其基因表達(dá)譜和基因改變存在差異，從而導(dǎo)致患者的臨床病程和對(duì)治療的反應(yīng)產(chǎn)生顯著差異[3]。雖然隨著利妥昔單抗免疫治療及諸多靶向新藥的應(yīng)用，DLBCL的治療療效有一定改善，但仍有30%～40%的患者存在原發(fā)耐藥、疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)現(xiàn)象，DLBCL仍然是一個(gè)重要的臨床挑戰(zhàn)[4-5]。因此，對(duì)DLBCL這種異質(zhì)性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層分析就變得越來越重要，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致針對(duì)不同的患者群體選擇不同的靶向治療。1993年起，國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評(píng)分在臨床上被用于侵襲性NHL患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層[6]。2014年，ZHOU等[7]利用美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）中的數(shù)據(jù)，通過細(xì)化年齡和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）分類，建立了改良的國際預(yù)后指數(shù)NCCN-IPI，以改進(jìn)NHL患者的風(fēng)險(xiǎn)分層。然而，盡管診斷標(biāo)準(zhǔn)不斷進(jìn)展，處于同一危險(xiǎn)組的患者仍表現(xiàn)出異質(zhì)性結(jié)局，這表明現(xiàn)有的用于DLBCL的預(yù)后因素在區(qū)分具有高危特征的患者時(shí)并不理想。因此，將IPI與其他分子標(biāo)志物結(jié)合可能進(jìn)一步提高其預(yù)后價(jià)值。

外泌體（exosomes）是一種可以被大多數(shù)細(xì)胞分泌的，直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡；外泌體被脂質(zhì)雙層包裹，存在于多種類型的細(xì)胞外液中，包括血液、尿液、羊水、唾液、腦脊髓液、甚至母乳[8]。攜帶各種生物分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝產(chǎn)物和核酸[9]。外泌體穩(wěn)定存在于大多數(shù)人體體液中，是理想的液體活檢樣本，其內(nèi)容物可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的標(biāo)志物[10-11]。血液中外泌體蛋白或核酸譜的改變與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的病理過程相關(guān)。然而，以往外泌體在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用研究主要集中在微RNA（microRNA，miRNA）上，隨著外泌體內(nèi)容物的快速規(guī)?；崛?、純化和篩選的發(fā)展，有望探索外泌體蛋白在早期癌癥診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用[12]。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）是一種復(fù)雜的多聚體糖蛋白，在原發(fā)性止血過程中起關(guān)鍵作用[13]。許多研究報(bào)道vWF與炎性反應(yīng)、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。有研究顯示，vWF可以介導(dǎo)胃癌細(xì)胞聚集并與血小板和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[15]；vWF還可與生長因子結(jié)合，促進(jìn)傷口部位的血管形成，從而在調(diào)節(jié)血管生成方面發(fā)揮重要作用[16]。還有研究顯示，vWF以嚴(yán)格依賴血小板和血小板糖蛋白GPIb的方式促進(jìn)白細(xì)胞從血管外滲[17]?，F(xiàn)已有一些關(guān)于實(shí)體瘤患者血漿vWF含量與預(yù)后關(guān)系的研究，但尚未有關(guān)于血清外泌體vWF的研究。本研究擬通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫比濁法檢測(cè)外泌體中vWF含量和活性，分析其與DLBCL患者預(yù)后的相關(guān)性，以期能更好的預(yù)測(cè)DLBCL患者的預(yù)后并提高其危險(xiǎn)分層能力。

1 資料和方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人DLBCL細(xì)胞SU-DHL-4由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存培養(yǎng)。RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自以色列BI公司。外泌體分離試劑盒Total Exosome Isolation Reagent（from serum）購自美國Thermo Fisher公司（貨號(hào)：4478360）。3%鉬酸銨負(fù)染色液購自北京索萊寶科技有限公司，300目碳覆膜銅網(wǎng)和反向自鎖鑷子購自上海百樞光電科技有限公司。鼠抗人CD63單克隆抗體和兔抗人Calnexin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人CD9單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司（貨號(hào)：13174），兔抗人腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）多克隆抗體購自美國Proteintech公司（貨號(hào)：14497-1-AP），兔抗人vWF單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司（貨號(hào)：65707S），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗）（貨號(hào)：ab6789）購自英國Abcam公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）（貨號(hào)：7074）購自美國Cell Signaling公司。預(yù)染蛋白marker（貨號(hào)：26616）購自美國Thermo Fisher科技公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒和蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蛋白酶體抑制劑（貨號(hào)：539131）和PVDF膜購自美國Millipore公司?；瘜W(xué)發(fā)光顯色液購自蘇州新賽美生物技術(shù)有限公司。人Von Willebrand Factor ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab108918）購自英國Abcam公司。免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）（型號(hào)：HT7700）為日本HITACHI公司產(chǎn)品，納米粒徑分析儀（型號(hào)：Zetasizer Nano S）為英國Malvern公司產(chǎn)品，蛋白電泳槽及轉(zhuǎn)膜裝置為美國Bio Rad公司產(chǎn)品。

1.2 病例收集及隨訪

選取38例2012年1月—2017年6月由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院血液科收治的，確診為DLBCL患者的臨床資料。其中，男性26例，女性12例，患者中位年齡61.5歲（范圍：26～86歲），按Ann Arbor分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期8例，Ⅳ期8例。收集各患者治療前的外周血清樣本，－80 ℃保存?；颊邞?yīng)用免疫化療治療原發(fā)病，且收樣前未接受任何抗腫瘤治療。本研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過，所有患者均已簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者年齡≥18歲；（2）經(jīng)病理學(xué)確診為DLBCL；（3）保存有足夠量的血清。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者年齡＜18歲；（2）原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)DLBCL；（3）合并其他惡性腫瘤。

所有患者均通過電話、電子病歷或輔助檢查等方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為2018年7月，其中失訪4例，隨訪率為89.47%，中位隨訪時(shí)間為28.59個(gè)月（范圍：6.33～75.57個(gè)月）。

1.3 血清外泌體的分離提取

取100 μL血清樣本通過2 000×g離心30 min，去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，將含有澄清血清的上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，然后加入其1/5體積的Total Exosome Isolation（from serum）試劑，將血清與試劑充分混勻后置于4 ℃條件下孵育30 min，然后在室溫條件下10 000×g離心10 min，外泌體沉淀在管底，除去上清液，用PBS重懸沉淀，即為分離獲得的外泌體。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法鑒定外泌體標(biāo)志蛋白

使用100 μL含有1 mmol/L蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解液冰上裂解100 μL外泌體和1×107個(gè)SU-DHL-4細(xì)胞，4 ℃ 10 000×g離心15 min，收集上清液。采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離蛋白，并將分離后的蛋白在100 V恒壓條件下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將蛋白膜用含5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，然后分別加入一抗 [兔抗人CD9和Calnexin單克隆抗體、鼠抗人CD63單克隆抗體和兔抗人TSG101多克隆抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）]，4 ℃孵育過夜。在搖床上用TBST清洗3次，每次10 min。加入相應(yīng)種屬的二抗[HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（體積稀釋比例為1∶5 000）或羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶2 000）]室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，用電化學(xué)發(fā)光顯色劑顯影，Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)成像。

1.5 透射電子顯微鏡檢測(cè)外泌體形態(tài)和大小

適當(dāng)稀釋外泌體溶液，取10 μL稀釋后的外泌體樣本滴于300目碳覆膜銅網(wǎng)上，靜置1 min，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體，滴10 μL的3%鉬酸銨于銅網(wǎng)上負(fù)染1 min后，濾紙從邊緣吸去多余的染液，滴一滴純水于銅網(wǎng)上，立即用濾紙從邊緣吸去多余的液體，重復(fù)3次，室溫晾干（約10 min），100 kV在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 納米粒徑分析儀檢測(cè)外泌體粒徑分布

取40 μL血清，提取外泌體后（流程同1.3節(jié)），用加入3 mL PBS重懸外泌體，混勻；將3 mL外泌體溶液加入與納米粒徑分析儀Zetasizer Nano S儀器配套的標(biāo)準(zhǔn)比色皿中，上機(jī)，利用動(dòng)態(tài)光散射來檢測(cè)外泌體的粒徑分布范圍。

1.7 ELISA法檢測(cè)血清及血清外泌體中vWF的含量

采用人Von Willebrand Factor ELISA試劑盒檢測(cè)血清及血清外泌體中vWF的含量，按操作手冊(cè)準(zhǔn)備所有試劑、工作標(biāo)準(zhǔn)液和樣品，平衡至室溫（18～25 ℃）。

制備樣品：取2 μL血清，使用1×稀釋液將血清稀釋至600 μL。取40 μL血清提取外泌體（流程同1.3節(jié)），加入40 μL PBS重懸外泌體，取2 μL外泌體樣品，用1×稀釋液稀釋至200 μL。

向每個(gè)孔中加入vWF標(biāo)準(zhǔn)液或上述制備獲得的樣品（50 μL），輕輕拍打培養(yǎng)板以徹底覆蓋孔，用密封膠帶蓋住培養(yǎng)板并孵育2 h；用PBS洗滌后，每個(gè)孔中加入50 μL生物素化的vWF抗體，輕輕拍打板以徹底覆蓋孔，除去氣泡并孵育2 h；用PBS洗滌培養(yǎng)板后；向每個(gè)孔中添加50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）偶聯(lián)物，孵育30 min；如上述方法清洗培養(yǎng)板；向每個(gè)孔中添加50 μL色原底物，并在環(huán)境光下孵育約20 min，直到形成最佳的藍(lán)色密度；向每個(gè)孔中添加50 μL終止溶液，顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色；立即在酶標(biāo)儀上讀取波長為450 nm和570 nm的D值，用450 nm處減去570 nm處的讀數(shù)以矯正光學(xué)缺陷；使用ElisaCalc軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最佳擬合線通過使用四參數(shù)對(duì)數(shù)曲線擬合的回歸分析來確定，并計(jì)算各樣品的濃度。

1.8 免疫比濁法檢測(cè)血清外泌體vWF的活性

從50 μL血清中提取外泌體（流程同1.3節(jié)），用1×PBS稀釋至600 μL，使用美國貝克曼TOP-700全自動(dòng)血凝儀，按照說明書上機(jī)操作，應(yīng)用免疫比濁法檢測(cè)血清外泌體vWF的活性。

1.9 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)淋巴瘤組織中vWF的含量

各選取3例分期為I期或Ⅲ＋Ⅳ期的DLBCL患者的石蠟標(biāo)本（共6例），使用病理切片機(jī)切片（切片厚度為3 μm），依次將切片放入二甲苯溶液→無水乙醇→85%乙醇溶液→75%乙醇溶液中脫蠟至水，再用蒸餾水沖洗。隨后組織切片置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH值＝6.0）中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，切勿干片。自然冷卻后將切片置于PBS（pH值＝7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片放入3%雙氧水溶液中，室溫避光孵育25 min，PBS洗滌切片。在組化圈內(nèi)滴加含3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。在切片上滴加一抗[兔抗人vWF單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）]，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌切片。在圈內(nèi)滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）覆蓋組織，室溫孵育50 min。PBS洗滌切片。在圈內(nèi)滴加DAB顯色液，光學(xué)顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染3 min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。將切片依次放入75%乙醇溶液→85%乙醇溶液→無水乙醇溶液Ⅰ→無水乙醇溶液Ⅱ→二甲苯溶液Ⅰ中脫水透明，稍晾干，中性樹膠封固。倒置光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)染色情況，采集圖像，使用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8和SPSS 21.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，定量資料以表示。2組間的差異采用Mann-Whitney檢驗(yàn)和非配對(duì)t檢驗(yàn)?；趌og-rank檢驗(yàn)的Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，利用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體的特征

使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白的存在，通過透射電子顯微鏡和納米粒徑分析儀來驗(yàn)證血清外泌體的形態(tài)特征和大小分布。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖1A）顯示，血清外泌體均表達(dá)外泌體特異性標(biāo)記蛋白CD63、CD9和TSG101，且不表達(dá)細(xì)胞內(nèi)容物鈣連蛋白Calnexin；反之，淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-4細(xì)胞缺乏CD63、CD9和TSG101的表達(dá)，但表達(dá)Calnexin。

透射電子顯微鏡下觀察結(jié)果（圖1B）提示，分離出的外泌體呈典型的茶托樣結(jié)構(gòu)，直徑為50～100 nm。納米粒徑分析儀下檢測(cè)結(jié)果（圖1C）顯示，外泌體的直徑約為30～150 nm。

上述結(jié)果表明，本研究用于外泌體分離的方法是可靠的，獲得的外泌體可用于后續(xù)研究。

Fig.1 Characterization of serum-derived exosomes.The expression of exosomal biomarker CD63,CD9 and tumor susceptibility gene 101 (TSG101),as well as cell content Calnexin on diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL) patients (3 cases) and lymphoma SU-DHL-4 cells were detected by Western blotting (A),and the morphology and size of exosomes were examined by transmission electron microscopy (B) and the size distribution range of exosomes was measured by Zetasizer Nano S (C).圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)DLBCL患者（3例）和淋巴瘤SU-DHL-4細(xì)胞上外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD9和TSG101以及細(xì)胞內(nèi)容物Calnexin的表達(dá)情況（A），并分別采用透射電子顯微鏡檢測(cè)外泌體的形態(tài)和大?。˙）以及納米粒徑分析儀Zetasizer Nano S檢測(cè)外泌體的粒徑分布范圍（C）

2.2 血清vWF含量與DLBCL患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性

38例DLBCL患者的臨床特征見表1。其中Ⅰ＋Ⅱ期者22例（57.89%），Ⅲ＋Ⅳ期者16例（42.11%）；IPI評(píng)分為0～2分者28例（73.68%），3～5分者10例（26.32%）。使用ELISA法檢測(cè)各患者血清中vWF的含量，根據(jù)血清vWF含量的中位值（10.2μg/mL）將38例DLBCL患者分為＜10.2μg/mL和≥10.2μg/mL組，每組各19例患者。結(jié)果顯示，血清vWF含量與患者的分期有關(guān)，Ⅰ＋Ⅱ期者血清vWF含量為（8.547±4.476）μg/mL，Ⅲ＋Ⅳ期者血清vWF含量為（15.980±11.570）μg/mL，提示分期越晚血清vWF含量越高（P＝0.016 3）（圖2A）；但血清vWF含量與患者的IPI評(píng)分（P＝0.061 2）（圖2B）及總生存（overall survival，OS）率（P＝0.141 9）（圖2C）和無進(jìn)展生存（progression-free survival，PFS）率（P＝0.053 6）（圖2D）均無關(guān)。

2.3 血清外泌體中vWF含量與DLBCL患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性

ELISA法檢測(cè)38例DLBCL患者血清外泌體中vWF含量，患者的臨床病理特征見表1。結(jié)果顯示，Ⅰ＋Ⅱ期組患者血清外泌體vWF含量為（6.813±2.799）μg/mL，Ⅲ＋Ⅳ期組患者為（16.770±11.610）μg/mL；與Ⅰ＋Ⅱ期組患者相比，分期越晚（Ⅲ＋Ⅳ期），患者血清外泌體vWF含量越高（Mann-Whitney檢驗(yàn)，P＝0.000 8）（圖3A）。IPI評(píng)分低（0～2）組患者血清外泌體中vWF含量為（8.268±5.577）μg/mL，IPI評(píng)分高（3～5）組患者為（18.670±12.780）μg/mL；與IPI評(píng) 分低組相比，IPI評(píng)分越高血清外泌體vWF含量也越高（P＝0.004 9）（圖3B）。根據(jù)血清外泌體vWF含量的中位值（8.6μg/mL）將DLBCL患者分為＜8.6 μg/mL及≥8.6 μg/mL組，每組各19例患者。Kaplan-Meier生存分析顯示，血清外泌體vWF含量高的DLBCL患者，其OS率（P＝0.003 8，圖3C）和PFS率（P＜0.000 1，圖3D）均低于vWF含量低的患者。上述結(jié)果提示，血清外泌體中vWF含量與患者的分期、IPI評(píng)分及預(yù)后均相關(guān)。

表1 DLBCL患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological features of 38 patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)Total＝38,n/%

Fig.2 The association between the level of serum von Willebrand factor (vWF) and Ann Arbor stage (A),international prognostic index (IPI) score (B),overall survival (OS) rate (C),and progression-free survival(PFS) rate (D) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients.圖2 血清vWF含量與DLBCL患者分期（A）、IPI評(píng)分（B）、OS率（C）和PFS率（D）之間的相關(guān)性

Fig.3 The association between the level of serum exosomal von Willebrand factor (vWF) and Ann Arbor stage (A),international prognostic index (IPI) score (B),overall survival (OS) rate (C),and progression-free survival (PFS) rate (D) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients.圖3 血清外泌體中vWF含量與DLBCL患者分期（A）、IPI評(píng)分（B）、OS率（C）和PFS率（D）之間的相關(guān)性

2.4 血清外泌體vWF活性與DLBCL患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性

采用免疫比濁法檢測(cè)38例DLBCL患者血清外泌體中vWF的活性，患者的臨床病理特征見表1。結(jié)果顯示，Ⅰ＋Ⅱ期組患者血清外泌體vWF活性為（4.26±5.19）%，Ⅲ＋Ⅳ期組患者為（12.18±10.51）%，與Ⅰ＋Ⅱ期組患者相比，分期越晚（Ⅲ＋Ⅳ期）患者血清外泌體vWF活性越高（P＝0.017 6）（圖4A）。IPI評(píng)分低（0～2）組患者血清外泌體vWF活性為（4.68±5.36）%，IPI評(píng)分高（3～5）組患者為（15.76±11.17）%；與IPI評(píng)分低（0～2）組相比，IPI評(píng)分越高（3～5），血清外泌體vWF活性也越高（P＝0.006 9）（圖4B）。根據(jù)血清外泌體vWF活性的中位值（4.85%）將DLBCL患者分為＜4.8%和≥4.8%組，每組各19例患者。Kaplan-Meier法生存分析顯示，血清外泌體vWF活性高的DLBCL患者，其OS率（P＝0.038 7，圖4C）和PFS率（P＝0.007 6，圖4D）均明顯低于vWF活性低的患者。上述結(jié)果提示，血清外泌體vWF活性與患者的分期、IPI評(píng)分及預(yù)后均具有相關(guān)性。

Fig.4 The association between serum exosomal von Willebrand factor (vWF) activity and Ann Arbor stage (A),international prognostic index (IPI) score (B),overall survival (OS) rate (C),and progression-free survival (PFS) rate (D) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients.圖4 血清外泌體vWF活性與DLBCL患者分期（A）、IPI評(píng)分（B）、OS率（C）和PFS率（D）之間的相關(guān)性

2.5 血清外泌體vWF含量及活性對(duì)DLBCL患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC分析結(jié)果（圖5）顯示，血清外泌體中vWF含量及活性對(duì)DLBCL患者OS的預(yù)測(cè)價(jià)值高，AUC分別為0.773 9（P＝0.014 1）和0.731 8（P＝0.037 8），且與IPI的預(yù)測(cè)能力相當(dāng)（AUC＝0.800 8，P＝0.007 0）；而血清外泌體vWF含量及活性對(duì)DLBCL患者PFS的預(yù)測(cè)價(jià)值更高，AUC分別為0.923 1（P＜0.000 1）與0.820 0（P＝0.001 4），且血清外泌體vWF含量對(duì)DLBCL患者PFS的預(yù)測(cè)能力要優(yōu)于IPI（AUC＝0.841 5，P＝0.000 6）。

Fig.5 Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis of serum exosomal von Willebrand factor(vWF) level,serum exosomal vWF activity and international prognostic index (IPI) on overall survival (OS)(A) and progression-free survival (PFS) (B) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients圖5 ROC法驗(yàn)證血清外泌體vWF含量、活性和IPI評(píng)分對(duì)DLBCL患者OS及PFS的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.6 淋巴瘤組織中vWF的表達(dá)水平

選取6例DLBCL患者（Ⅰ期和Ⅲ＋Ⅳ期各3例），采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)患者腫瘤組織中vWF的表達(dá)量。結(jié)果（圖6）顯示，Ⅲ～Ⅳ期患者腫瘤組織中vWF的表達(dá)量明顯高于Ⅰ期患者（P＝0.002 4）；這一結(jié)果提示，分期越晚，DLBCL患者腫瘤組織中vWF表達(dá)呈升高趨勢(shì)。在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤組織中vWF主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞中，而在腫瘤細(xì)胞中未見有表達(dá)。

Fig.6 The expression level of von Willebrand factor (vWF) in tumor tissues of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients with different stages were detected by immunohistochemistry (DAB staining,×200).圖6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同分期DLBCL患者腫瘤組織中vWF的表達(dá)水平

3 討論

靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是癌癥患者死亡的一個(gè)主要原因[18]。淋巴瘤患者發(fā)生VTE的風(fēng)險(xiǎn)增加，然而對(duì)于這種潛在的遺傳性或獲得性血栓形成傾向的原因目前仍然知之甚少[19]。一項(xiàng)對(duì)1 038例侵襲性及惰性NHL和霍奇金病患者的研究發(fā)現(xiàn)，其中有8%的患者發(fā)生了血栓栓塞事件[20]。惡性腫瘤或化療可引起的內(nèi)皮細(xì)胞、促凝細(xì)胞因子和血小板活化，而遺傳和獲得性血栓形成因子都與惡性疾病患者血栓栓塞的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[21]。血漿vWF抗原水平升高與VTE風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)[22]。vWF作為凝血因子Ⅷ的伴侶蛋白，可將其傳遞到損傷部位，穩(wěn)定凝血因子Ⅷ的異二聚體結(jié)構(gòu)，并保護(hù)其在血漿中不被過早清除。已有研究顯示，血漿vWF含量及活性在淋巴瘤患者中升高，并與凝血因子Ⅷ的含量具有相關(guān)性[19]。然而，目前尚沒有血漿vWF含量與淋巴瘤患者預(yù)后的相關(guān)研究報(bào)道。本課題組前期專注于研究血清外泌體與DLBCL患者預(yù)后的相關(guān)性，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體vWF是與DLBCL患者預(yù)后有關(guān)的一種危險(xiǎn)因素，因此本研究采用ELISA法檢測(cè)血清中vWF的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清vWF含量與DLBCL患者的分期相關(guān)，分期越晚，血清vWF含量越高。這與在其他腫瘤的研究結(jié)果相一致，vWF水平已被證明在多種實(shí)體瘤中顯著升高，并與腫瘤的大小和分級(jí)有關(guān)[23]。有研究顯示，高水平的血漿vWF在結(jié)直腸癌[24]、肺癌[25]、卵巢癌[26]和惡性膠質(zhì)瘤[27]中與患者更差的預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，血清vWF含量高的DLBCL患者，其OS及PFS率明顯低于血清vWF含量低的患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于本研究的樣本量較少的緣故，未來仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步予以檢測(cè)分析。

由于外泌體體積小，穿透組織屏障能力強(qiáng)，廣泛存在于多種體液中，因此臨床檢測(cè)較便捷[12]。此外，外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)使其內(nèi)容物在血液循環(huán)中不能被細(xì)胞外的蛋白酶降解，具有高度的穩(wěn)定性，可長期保存[28]。另外，由于血液成分的復(fù)雜性，血清中存在的高豐度蛋白使得部分低豐度蛋白很難檢測(cè)到，而這部分低豐度蛋白很可能是潛在的生物標(biāo)志物，分離提取血清中的外泌體可以有效去除大部分血清高豐度蛋白，并顯著降低體液的復(fù)雜性，從而有助于癌癥早期篩查潛在生物標(biāo)志物的低豐度蛋白[12,28]。相較于血清，外泌體提供了一個(gè)更純凈的不含血漿蛋白的生物樣本，從而使生物標(biāo)志物的分析和驗(yàn)證更加容易。對(duì)外泌體的分析是開發(fā)用于監(jiān)測(cè)癌癥的新型蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的一種途徑，外泌體蛋白正在成為癌癥監(jiān)測(cè)和療效評(píng)估的極具前景的臨床預(yù)后工具。例如，外泌體磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1，GPC1）可能作為一種潛在的非侵入性診斷和篩查工具來檢測(cè)早期胰腺癌，從而及時(shí)進(jìn)行根治性手術(shù)治療[29]；血清細(xì)胞外囊泡富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）和富含亮氨酸的α-2糖蛋白1（leucine rich alpha-2 glycoprotein 1，LRG1）可能是結(jié)腸癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[30]；腹腔積液來源的外泌體中高糖基化CD133可作為晚期胰腺癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[31]；外泌體碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）可以通過核因子-κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路促進(jìn)化療耐藥，并可作為DLBCL患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[32]。目前尚無外泌體vWF蛋白與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性研究。本研究首次探討了DLBCL患者血清vWF含量、血清外泌體vWF含量及活性對(duì)DLBCL患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示，血清vWF含量僅與患者的分期有關(guān)，而血清外泌體vWF含量及活性則與患者的分期、IPI評(píng)分及預(yù)后均顯著相關(guān)，對(duì)于患者的OS與PFS具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，可以作為DLBCL患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。該結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，相較于血清，血清外泌體蛋白可作為一種更有潛力的預(yù)后標(biāo)志物。

越來越多的證據(jù)表明，血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞激活在實(shí)體腫瘤和惡性血液腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展中起著重要作用[33-35]。在多種惡性腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)，骨髓血管密度和血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）濃度升高。HUSSONG等[36]通過觀察20例急性髓系白血病患者的骨髓血管密度和對(duì)vWF染色后發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，腫瘤患者中血管生成增加。NEGAARD等[37]分析了93例血液惡性腫瘤患者的骨髓血管密度以及一系列血管生成因子，結(jié)果表明骨髓血管生成在多發(fā)性骨髓瘤和NHL的發(fā)病和進(jìn)展中起著重要作用。vWF作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子標(biāo)志物，在體內(nèi)僅在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中合成[38]。在巨核細(xì)胞和其產(chǎn)生的血小板中，vWF儲(chǔ)存在α顆粒中。內(nèi)皮細(xì)胞合成的vWF，則既可以直接分泌到血漿中，也可以儲(chǔ)存在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞器中，因此稱之為Weibel-Palade bodies（WPB）。已有研究顯示，不同病理亞型NHL的微血管密度隨其惡性度的增高而逐漸升高[39]。本研究中采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了6例DLBCL患者腫瘤組織中vWF蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分期晚的DLBCL患者腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的vWF表達(dá)量高于分期早的DLBCL患者，提示分期晚的DLBCL患者腫瘤組織的血管生成增多，但仍需進(jìn)一步分析淋巴瘤組織中的微血管密度予以確認(rèn)，由于樣本量較少，該結(jié)果還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所訴，血清外泌體vWF含量及活性，與DLBCL患者的分期及IPI評(píng)分存在相關(guān)性，并能顯著區(qū)分患者的OS與PFS，可作為DLBCL的一種潛在預(yù)后標(biāo)志物。相較于血清vWF，血清外泌體vWF具有更好的臨床預(yù)后價(jià)值，ELISA及免疫比濁法檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)也為其臨床應(yīng)用提供了便利。