p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HSIL+病變?cè)\斷的臨床價(jià)值

簡(jiǎn)鳳萍 羅燕艷 梁銳根 徐秀梅 鄧文同

1 中山市博愛(ài)醫(yī)院婦產(chǎn)科 (中山 528400)

2 中山市博愛(ài)醫(yī)院病理科 (中山 528400)

宮頸癌是一個(gè)全球性的問(wèn)題, 位居女性生殖道腫瘤第一位, 35 歲以下惡性腫瘤第一位[1-2]。 中國(guó)宮頸癌發(fā)病率15/10 萬(wàn), 近年來(lái)發(fā)病趨勢(shì)明顯年輕化, 且早期患者增多[3]。 50 年以來(lái)大部分國(guó)家宮頸癌還以細(xì)胞學(xué)篩查為主, 但是細(xì)胞學(xué)靈敏度較低, 而HPV 初篩的臨床應(yīng)用缺點(diǎn)是具有特異度較低等局限性[4]。 近年來(lái)細(xì)胞學(xué)與HPV 檢測(cè)聯(lián)合篩查策略逐漸成為宮頸癌篩查共識(shí)。 穆啟梅等[5]探討了TCT、 HPV-DNA 分型檢測(cè)在細(xì)胞檢查結(jié)果≥ASCUS 和病理組織學(xué)檢測(cè)≥CINⅠ患者的癌前病變篩查價(jià)值。 而WHO 發(fā)布的最新的宮頸疾病分類(lèi)依據(jù)[6]認(rèn)為包括CIN2 和CIN3 在內(nèi)的HSIL 早期診斷給婦產(chǎn)科醫(yī)師帶來(lái)的挑戰(zhàn)是巨大的。 而有創(chuàng)的病理活檢常常不容易被接受。 探討一種無(wú)創(chuàng)性的早期HSIL+顯得非常迫切而重要。

本研究通過(guò)縱向比較 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)在不同級(jí)別宮頸病變的陽(yáng)性率的差異, 橫向比較p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)在相同宮頸病變的陽(yáng)性率的差異, 綜合評(píng)估 p16/Ki- 67 染色、 HPV E6/E-7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)診斷HSIL +病變效能的差異,旨在建立一種靈敏、 特異、 無(wú)創(chuàng)的HSIL +病變?cè)缙谠\斷方法。

1 資料與方法

1.1 材料收集

選取2017 年3 月—2020 年8 月期間, 于中山市博愛(ài)醫(yī)院婦產(chǎn)科就診, 組織學(xué)證實(shí)為宮頸炎患者209 例、 LSIL 患者 169 例、 HSIL 患者 131 例和宮頸癌患者86 例作為研究對(duì)象。 宮頸炎組患者年齡23 ～78 歲, 平均年齡 (41.9 ± 12.6) 歲; LSIL 組患者年齡 21 ～81 歲, 平均年齡 (42.3 ± 11.2)歲; HSIL 組患者年齡25 ～79 歲, 平均年齡 (43.6±9.8) 歲; 宮頸癌組患者年齡25 ～82 歲, 平均年齡 (43.5 ±13.0) 歲; 四組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05), 具有可比性。 入選標(biāo)準(zhǔn): 研究對(duì)象均為宮頸原發(fā)性疾病; 未合并有其他腫瘤; 未接受過(guò)宮頸疾病的藥物、 放化療及靶向治療; 非生理期、 非妊娠期、 非哺乳期。

1.2 設(shè)備與試劑

P16/Ki-67 染色抗體由美國(guó) Ventana Medical Systems 公司生產(chǎn)。 HPV E6/E7mRNA 分子檢測(cè)儀、ThinPrep2000 細(xì)胞制作儀購(gòu)自美國(guó) Hologic 公司。HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)試劑由科蒂亞生物公司生產(chǎn)。

1.3 標(biāo)本制作與診斷

由婦產(chǎn)科醫(yī)師采集患者宮頸標(biāo)本并制作宮頸細(xì)胞薄片, 在陰道鏡下, 采集宮頸病理標(biāo)本, 固定、脫水、 包埋、 透明、 浸蠟、 包埋、 切片、 染色, 按參考文獻(xiàn)執(zhí)行[7]。 組織學(xué)診斷由2 位病理醫(yī)師共同完成。

1.4 宮頸組織學(xué)診斷依據(jù)

宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果依據(jù)WHO 發(fā)布的最新的Bethesda[6], 包括宮頸炎 (良性細(xì)胞改變)、 LSIL、HSIL、 宮頸癌。 LSIL 相當(dāng)于原來(lái)的 CIN1, HSIL 相當(dāng)于原來(lái)的CIN2 和CIN3。

1.5 p16/Ki-67 染色檢測(cè)

利用免疫學(xué)抗原抗體分子由于結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)和彼此親和性所發(fā)生特異性結(jié)合原理, 并通過(guò)氧化還原化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的酶顯色劑顯色來(lái)確定細(xì)胞內(nèi)抗原, 對(duì)其進(jìn)行定位、 定性。 實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照。 檢測(cè)結(jié)果由病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色后薄片進(jìn)行觀察并進(jìn)行判斷。 陽(yáng)性染色結(jié)果是指薄片中見(jiàn)一個(gè)以上細(xì)胞的細(xì)胞核呈紅色著色、 細(xì)胞質(zhì)呈黃色。 陰性染色結(jié)果是指薄片中除外同一細(xì)胞的細(xì)胞核呈紅色著色、 細(xì)胞質(zhì)呈黃色的所有情況[8-9]。見(jiàn)圖1。

圖1 p16/Ki-67 染色圖像 (Envision 法, ×400)

1.6 HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)

采用HPV E6/E7mRNA 分子檢測(cè)儀進(jìn)行診斷,可檢測(cè) HPV16、 18、 31、 33 在內(nèi)的 14 種高危型HPV。 HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性 (紅色)、陰性 (黑色)。

1.7 聯(lián)合檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)中p16/Ki-67 和HPV E6/E7mRNA 聯(lián)合檢測(cè)采用并聯(lián)的方式: 即兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中只要有一個(gè)為陽(yáng)性即診斷為聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性。 只有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)為陰性才診斷為聯(lián)合檢測(cè)陰性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成數(shù)據(jù)分析, 率的比較采用χ2檢驗(yàn), 均數(shù)的比較采用方差分析 。HSIL+為本研究的終點(diǎn) (包括HSIL 和宮頸癌)。HSIL- (包括 LSIL 和宮頸炎)。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)在不同級(jí)別宮頸病變的陽(yáng)性率的比較

p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率隨宮頸病變程度的加重呈趨勢(shì)性升高(p16/Ki-67 染色:χ2=374.34,P＜ 0.001; HPV E6/E7mRNA 檢測(cè):χ2=289.21,P＜ 0.001; 聯(lián)合檢測(cè)檢測(cè):χ2=343.90,P＜0.001), 見(jiàn)表 1。

表1 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率與宮頸病變橫向和縱向的比較 %

2.2 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)在相同級(jí)別宮頸病變的陽(yáng)性率的比較

在宮頸炎、 LSIL、 宮頸癌組, p16/Ki-67 染色、HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率之間差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P＞0.05)。 而在 HSIL 組,p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2= 12.23,P=0.002)。 進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn): 在HSIL 組, p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)之間陽(yáng)性率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2= 0.29,P= 0.29);p16/Ki-67 染色和聯(lián)合檢測(cè)之間陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=8.09,P=0.004); HPV E6/E7mRNA和聯(lián)合檢測(cè)之間陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=11.30,P=0.001), 見(jiàn)表 1。

2.3 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)診斷HSIL+病變效能比較

表2 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)診斷HSIL+病變效能比較

本文以組織學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn), p16/Ki-67染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)診斷HSIL +病變的靈敏度、 特異度、 符合率見(jiàn)表2。 三種檢測(cè)方法診斷HSIL +的靈敏度, 總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2= 7.69,P= 0.021)。 進(jìn)一步兩兩比較,p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)法之間的靈敏度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.27,P=0.61); p16/Ki-67 染色與聯(lián)合檢測(cè)法之間的靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2= 7.29,P= 0.007);HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)法之間的靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=4.84,P=0.028)。 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)診斷HSIL +的特異度及符合率的總體差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.628)。

3 討 論

35 ～64 歲需要接受宮頸癌篩查的中國(guó)女性約3 億, 宮頸癌篩查不是一道單選題, 理想的宮頸癌篩查方案應(yīng)該是篩查益處最大化: 敏感性高,及早發(fā)現(xiàn)高級(jí)別癌前病變及已患浸潤(rùn)癌人群; 無(wú)痛、 無(wú)創(chuàng)、 成本低廉, 病人依從性好; 更加明確的臨床管理。 潛在危害最小化: 特異性高、 找出真正向?qū)m頸癌進(jìn)展的病變; 簡(jiǎn)單的判讀方式, 減少人為主觀因素對(duì)結(jié)果的影響; 減少一過(guò)性HPV感染帶來(lái)的心理壓力和不必要的創(chuàng)傷檢查。 細(xì)胞學(xué)、 組織病理學(xué)、 陰道鏡醫(yī)師缺乏規(guī)范化培訓(xùn)和質(zhì)量控制參差不齊是目前國(guó)內(nèi)宮頸癌篩查水平差距較大的主要原因。

2014 年WHO 女性生殖系統(tǒng)腫瘤推薦p16/Ki-67 用于宮頸病變輔助診斷[10]。 劉玉艷等[11]研究發(fā)現(xiàn): p16/Ki-67 染色可提高細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的敏感性和HPV 檢測(cè)的特異性, 有效提髙宮頸癌篩查效率。陳飛等[12]研究認(rèn)為: HPV E6/E7mRNA、 p16 /Ki67 表達(dá)與宮頸病變程度密切相關(guān), 可輔助ASCUS 患者的分流診斷。

mRNA 是一大類(lèi)RNA 分子, 它將遺傳信息從DNA 傳遞到核糖體, 在那里作為蛋白質(zhì)合成模板并決定基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物肽鏈的氨基酸序列。 E6、E7 是高危型HPV 病毒的兩致癌基因, 是導(dǎo)致宮頸發(fā)生高級(jí)別病變乃至癌變的元兇。 在病毒感染的早期, E6、 E7 基因處于靜默期, 不表達(dá)或者低表達(dá)mRNA, 一過(guò)性HPV 感染大多處于這個(gè)階段。 約4/5 的女性一生當(dāng)中都曾感染過(guò)HPV, 但大部分感染會(huì)在一到兩年內(nèi)自動(dòng)清除或者被自身免疫力抑制, 不會(huì)呈持續(xù)性的陽(yáng)性狀態(tài)。

p16 是腫瘤抑制因子, Ki-67 是細(xì)胞增殖標(biāo)志物, 在正常細(xì)胞周期中, p16 和Ki-67 不會(huì)同時(shí)表達(dá)在同一個(gè)細(xì)胞中。 反之, 如果p16 和Ki-67 同時(shí)表達(dá)在同一個(gè)細(xì)胞中, 說(shuō)明細(xì)胞增殖失控, 極大概率提示宮頸高度病變和宮頸癌的發(fā)生。

表1 從縱向比較了p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率隨宮頸病變程度的加重而升高, 反映出 p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E-7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)與宮頸癌的發(fā)生是緊密相關(guān)的。這一研究結(jié)果與Daniela G[13]及Liu TY[14]等報(bào)道p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)與宮頸癌發(fā)生密切關(guān)聯(lián)的研究結(jié)論一致。

表1 還從橫向比較了宮頸炎、 LSIL、 宮頸癌組, p16/Ki-67 染色、 HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率之間差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P＞0.05)。 而有趣的是在 HSIL 組, p16/Ki-67 染色、HPV E6/E7mRNA 和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=12.23,P=0.002)。 對(duì)于 HSIL 病例的早期診斷正是臨床醫(yī)師重點(diǎn)關(guān)注的病例, 而恰好p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 聯(lián)合檢測(cè)能更有效甄別這部分病例, 對(duì)于預(yù)防宮頸癌的發(fā)生具有重要的臨床價(jià)值。 這一實(shí)驗(yàn)結(jié)論與王茂等[15-16]報(bào)道相一致。

本研究從重點(diǎn)考察指標(biāo)靈敏度、 特異度、 符合率等報(bào)道 p16/Ki-67、 HPV E6/E7mRNA、 聯(lián)合檢測(cè)診斷HSIL+病變的臨床價(jià)值, 表2 的研究結(jié)果反映出三種檢測(cè)方法均可應(yīng)用于HSIL+病變的篩查, 但是聯(lián)合檢測(cè)能顯著提高HSIL +病變?cè)\斷的靈敏度,降低漏診率, 同時(shí)保持了較好的特異度和符合率,建議將p16/Ki-67 染色和HPV E6/E7mRNA 聯(lián)合檢測(cè)作為早期診斷HSIL+病變的策略。

與此同時(shí), 我們應(yīng)該看到聯(lián)合檢測(cè)在有效提高篩查靈敏度的同時(shí), 降低了特異度, 而且增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 如何甄別聯(lián)合檢測(cè)的假陽(yáng)性病例,確保其特異性, 而且進(jìn)一步合理聯(lián)合檢測(cè)的費(fèi)用,這是擺在婦產(chǎn)科醫(yī)師和病理醫(yī)師面前的機(jī)遇和挑戰(zhàn), 如果能解決這些問(wèn)題, 將會(huì)使更多宮頸癌前病變患者被早期發(fā)現(xiàn), 為女性的生命健康保駕護(hù)航。