血栓心脈寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

吉 潔，梅 俊，朱 穎，張 穎，徐鳳芹

隨著我國(guó)人民生活水平的提高及老齡化進(jìn)程的加快，與代謝相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病患病率逐年升高，由此引發(fā)的心血管病死亡占居民總死亡比例已超過(guò)40%[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中和外周動(dòng)脈疾病等多種心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，因此，抗動(dòng)脈粥樣硬化研究一直是心腦血管疾病防治領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。然而動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、脂質(zhì)代謝、血管重構(gòu)等多種因素。根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)將其歸為“胸痹”“真心痛”“中風(fēng)”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病機(jī)為臟腑、氣血、津液功能失調(diào)，瘀血、痰濁、水飲等病理產(chǎn)物為其標(biāo)，多采用益氣活血化瘀、清熱解毒、化痰祛濁等治法。

血栓心脈寧基于“血脈雙治”理論研制而成，全方由川芎、丹參、毛冬青、水蛭、槐花、人工麝香、冰片、人工牛黃、人參莖葉皂苷、蟾酥等10味藥組成。方中川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛；丹參活血養(yǎng)血，止痛安神，兩藥配伍，氣血并治，共為君藥。水蛭破血逐瘀通經(jīng)；麝香開(kāi)竅醒神、止痛消腫；毛冬青清熱解毒、通脈活血；槐花清肝瀉火，活血解毒，共助君藥通行血脈、逐瘀通痹、活血止痛，共為方中臣藥。人參莖葉總皂苷扶正固元；冰片透達(dá)心脈，通經(jīng)止痛；牛黃清心涼肝，清熱解毒，三藥共佐君臣活血化瘀、通絡(luò)止痛，活血為主兼顧解毒清熱之功。蟾酥解毒消腫，強(qiáng)心止痛，可加強(qiáng)君臣藥的活血化瘀，又可引諸藥直達(dá)病所，皆為佐使之用。全方合用，血脈同治，瘀毒并清，益氣活血通脈，化瘀解毒。血栓心脈寧在臨床治療上廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中、心絞痛等疾病[2-3]。藥理研究顯示血栓心脈寧可抗心肌缺血[4]、改善血液流變學(xué)及抗血小板聚集[5]、改善微循環(huán)障礙[6]、抗氧化活性及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[7-8]等。

中藥包含多組分、多靶點(diǎn)，各組分之間可產(chǎn)生協(xié)同作用，形成的體系龐大復(fù)雜。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多靶點(diǎn)研究策略出發(fā)，通過(guò)挖掘網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和功能模塊，分析藥物、靶點(diǎn)、疾病之間的相互關(guān)系，超越了單靶點(diǎn)思想構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的束縛，其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治的理論特點(diǎn)不謀而合[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)概念、方法和技術(shù)應(yīng)用到了藥物相關(guān)的研究，其在藥物靶點(diǎn)選擇、新的適應(yīng)證預(yù)測(cè)、挖掘藥物研發(fā)規(guī)律等方面都應(yīng)用頗廣。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對(duì)血栓心脈寧片主要功效物質(zhì)以及配伍機(jī)制進(jìn)行研究，以期揭示血栓心脈寧片治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制及科學(xué)內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 血栓心脈寧片成分及作用靶標(biāo)預(yù)測(cè) 血栓心脈寧片組成包括川芎、丹參、毛冬青、水蛭、槐花、人工麝香、冰片、人工牛黃、人參莖葉皂苷、蟾酥10味中藥。本研究使用BATMAN-TCM平臺(tái)[10]預(yù)測(cè)復(fù)方成分及其作用靶標(biāo)。將血栓心脈寧片中10種中藥組成分別導(dǎo)入BATMAN-TCM平臺(tái)進(jìn)行靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)及分析；之后通過(guò)計(jì)算“血栓心脈寧片化合物-靶標(biāo)”與“已知藥物-靶標(biāo)”之間的相似性，對(duì)潛在的藥物靶標(biāo)相互作用進(jìn)行score打分[11]，并以score≥20分的靶標(biāo)作為潛在的靶標(biāo)基因。

1.2 靶標(biāo)基因富集分析 基于功能條目富集分析靶標(biāo)，以此考察中藥的潛在靶標(biāo)及其可能具有的生物學(xué)功能、參與的生物學(xué)通路。靶標(biāo)的富集分析涉及Drug Bank[12]、基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析[13]以及OMIM/TTD[14]。疾病的功能分析是基于超幾何分布設(shè)計(jì)的算法，Benjamini-Hochberg校正方法進(jìn)行多重校驗(yàn)[15]。如果靶標(biāo)在這些條目上超幾何分布校驗(yàn)后的P值小于設(shè)定值，即P<0.05，即可認(rèn)為靶標(biāo)在這些條目上富集。同時(shí)給出這些靶蛋白顯著富集的KEGG生物學(xué)通路、GO功能注釋條目(包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能以及細(xì)胞定位三大類)、OMIM/TTD疾病通路，還有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的P值、條目相關(guān)的基因數(shù)量和基因列表等信息。根據(jù)這些顯著富集的KEGG生物學(xué)通路和GO功能條目，可以推測(cè)其可能在治療疾病中發(fā)揮著重要角色，并且也為進(jìn)行下一步分子作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了些許線索。

1.3 分析與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的靶標(biāo)基因與通路 將化合物與他們潛在的靶標(biāo)、相關(guān)的疾病以及通路相關(guān)聯(lián)，構(gòu)建“組成化合物-靶標(biāo)-生物學(xué)通路-疾病”的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，這樣能夠探索不同組分潛在的作用機(jī)制。并且使用Cytoscape 3.2.0繪制關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，將化合物、靶標(biāo)、生物學(xué)通路及疾病以不同顏色和形狀的節(jié)點(diǎn)來(lái)表示。

2 結(jié) 果

2.1 血栓心脈寧片的潛在靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)BATMAN-TCM平臺(tái)檢索血栓心脈寧片所含化合物有789種，如川芎中的川芎嗪、藁本內(nèi)酯、阿魏酸等，人參中的人參皂苷Re、Rb1、Rb2等。以化合物在BATMAN-TCM平臺(tái)獲取的靶標(biāo)基因，score≥20分的靶標(biāo)基因共有2 201個(gè)，現(xiàn)列出預(yù)測(cè)的24個(gè)潛在藥物靶標(biāo)基因。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索這些基因?qū)?yīng)的蛋白，包括與脂代謝相關(guān)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)、調(diào)節(jié)膽固醇攝取相關(guān)的核受體(NR1H3、NR1H2)、調(diào)節(jié)糖脂代謝的脂聯(lián)素(ADIPOQ)等。詳見(jiàn)表1。

2.2 潛在靶標(biāo)分析的功能分布 利用生物學(xué)通路潛在靶標(biāo)分析方法，分析了其中2 201個(gè)潛在靶標(biāo)分子，發(fā)現(xiàn)其在94個(gè)功能條目顯著富集(P<0.05)，如信號(hào)傳導(dǎo)活性(signal transduction)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolic process)、細(xì)胞增殖(cell proliferation)等。部分顯著富集的功能條目見(jiàn)表2。

表2 血栓心脈寧片部分靶標(biāo)基因功能分布

2.3 潛在靶標(biāo)基因分析KEGG通路分布及可視化呈現(xiàn) 通過(guò)生物學(xué)通路分析方法，分析了2 201個(gè)潛在靶標(biāo)分子的KEGG生物學(xué)通路的分布，發(fā)現(xiàn)這些靶標(biāo)分子傾向在環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-蛋白激酶信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)、腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路(AMPK signaling pathway)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路(TGF-β signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)等78個(gè)通路顯著富集(P<0.05)。部分顯著富集的生物學(xué)通路見(jiàn)表3。

表3 血栓心脈寧片部分靶標(biāo)基因KEGG通路分布

2.4 生物學(xué)通路的可視化 靶標(biāo)相互作用對(duì)象以及他們與上下游分子的調(diào)控關(guān)系，其可通過(guò)對(duì)靶標(biāo)分析得到富集的KEGG生物學(xué)通路呈現(xiàn)。本研究中列出了潛在靶標(biāo)在AMPK信號(hào)通路上的覆蓋情況。詳見(jiàn)圖1。

圖1 潛在靶標(biāo)在AMPK信號(hào)通路的作用路徑

2.5 潛在的靶標(biāo)基因分析之疾病分布 利用靶標(biāo)分析方法，分別基于OMIM和TTD數(shù)據(jù)進(jìn)行了2 201個(gè)潛在靶標(biāo)分子(score≥20分)的疾病富集分析，發(fā)現(xiàn)在26個(gè)TTD疾病條目顯著富集(P<0.05)，如心律失常、心力衰竭、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心臟相關(guān)疾病。部分顯著富集的疾病見(jiàn)表4。

表4 血栓心脈寧片部分靶標(biāo)基因顯著富集的疾病分布

2.6 與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的潛在靶標(biāo)-生物學(xué)通路/疾病的網(wǎng)絡(luò)可視化 將238個(gè)化合物與他們的1 307個(gè)潛在靶標(biāo)、相關(guān)的疾病(51個(gè)OMIM、95個(gè)TTD)與152個(gè)通路關(guān)聯(lián)，同時(shí)針對(duì)顯著富集的通路、疾病條目構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。本研究重點(diǎn)關(guān)注了動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶標(biāo)-生物學(xué)通路/疾病的網(wǎng)絡(luò)可視化。詳見(jiàn)圖2。在組成化合物-靶標(biāo)-生物學(xué)通路-疾病的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖中，不同類型的結(jié)果分別用不同的顏色和形狀表示，其中綠色七邊形表示草藥，淺灰色正方形為組成化合物，紅色圓形表示藥物的潛在靶標(biāo)，紫色的三角形為KEGG生物學(xué)通路，棕色正方形為疾病。在圖2中還包含了三種聯(lián)系(邊)，化合物與靶標(biāo)的聯(lián)系、靶標(biāo)與通路的聯(lián)系、靶標(biāo)與OMIM/TTD疾病的聯(lián)系。靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)、生物學(xué)通路節(jié)點(diǎn)以及疾病節(jié)點(diǎn)的大小，會(huì)隨著網(wǎng)絡(luò)中的連接度而變化，一般連接度越大，節(jié)點(diǎn)越大。而相關(guān)的化合物數(shù)量決定靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)的連接度，相關(guān)的靶標(biāo)數(shù)量決定生物學(xué)通路節(jié)點(diǎn)的連接度以及其與疾病條目節(jié)點(diǎn)的連接度。

圖2 與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的潛在靶標(biāo)-生物學(xué)通路/疾病網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)到血栓心脈寧片的潛在靶標(biāo)基因2 201個(gè)，有78條通路顯著富集，如cGMP-PKG信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，涉及血管功能的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)運(yùn)輸與降解、糖脂代謝等過(guò)程。有研究表明，cGMP-PKG信號(hào)通路在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用[16]。AMPK作為調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶，是真核生物細(xì)胞和有機(jī)體代謝的中心調(diào)節(jié)劑之一，已有研究證明AMPK是一個(gè)參與多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白，對(duì)心血管疾病、腫瘤細(xì)胞等的治療起著重要作用。MAPK信號(hào)通路參與動(dòng)脈粥樣硬化早期的炎癥反應(yīng)調(diào)控，有研究顯示p38MAPK與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有密切聯(lián)系。

由圖2可知，組方藥物多個(gè)化合物共同作用于ADIPOQ、ABCA1、ROCK1、SCARB1等靶標(biāo)，并且其直接參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、膽固醇攝取、血管功能的調(diào)節(jié)，影響糖脂代謝等代謝過(guò)程，與心律失常、心力衰竭、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心臟相關(guān)疾病聯(lián)系緊密。研究顯示，脂聯(lián)素由ADIPOQ基因編碼，參與心血管和代謝疾病的發(fā)病機(jī)制[17]。ABCA1是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要作用是通過(guò)控制細(xì)胞膽固醇和磷脂的流出來(lái)維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，具有抗炎作用，參與動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病[18-21]。研究顯示，內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是動(dòng)脈粥樣硬化的主要特征，在高糖刺激下，ROCK1的激活在內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到了重要作用[22]。SCARB1在高密度脂蛋白膽固醇代謝中起到了重要作用，SCARB1的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化中具有保護(hù)作用，可能參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病機(jī)制[23-26]。任智雄等[3]對(duì)血栓心脈寧片治療氣虛血瘀型心絞痛的有效性和安全性進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)其可提高心絞痛改善率和心電圖療效率。血栓心脈寧片還參與了神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、代謝綜合征、哮喘、癲癇等疾病。

本研究依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路和研究方法，從分子水平揭示了血栓心脈寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化的可能成分及作用機(jī)制，為未來(lái)的研究提供了一定線索。然而本研究亦存在一定的不足之處，由于目前中藥成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)算法的局限性，導(dǎo)致BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)不一定能全面預(yù)測(cè)中藥成分的相關(guān)靶標(biāo)，靶基因預(yù)測(cè)的局限性會(huì)影響本研究對(duì)血栓心脈寧片有效成分的全面認(rèn)識(shí)，另無(wú)法預(yù)測(cè)不同藥物組分的相互作用、無(wú)法量化藥物的藥理作用，而且不能預(yù)測(cè)尚未發(fā)現(xiàn)的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，血栓心脈寧片可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，為此藥物的后續(xù)物質(zhì)基礎(chǔ)研究和分子作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究提供了一定可參考的理論基礎(chǔ)。未來(lái)可針對(duì)各藥物中含量較高且藥理活性顯著的已知成分進(jìn)行深入研究，期待能在后續(xù)的基礎(chǔ)研究中對(duì)預(yù)測(cè)的靶標(biāo)基因和通路進(jìn)行驗(yàn)證，深入探索血栓心脈寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。