基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究靈寶護(hù)心丹治療急性心肌梗死的潛在機(jī)制

譚 宇，史大卓，柴 華，馬曉娟

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指各種原因?qū)е鹿跔顒?dòng)脈血供急劇減少或完全中斷，使相應(yīng)供血區(qū)域的心肌急性缺血性壞死的心血管疾病，是冠心病的嚴(yán)重類型，嚴(yán)重危害人類健康，是全球死亡的主要原因之一?！吨袊?guó)心血管病報(bào)告2018》概要指出：我國(guó)現(xiàn)有冠心病病人1 100萬(wàn)人，且冠心病的發(fā)病率、死亡率逐年升高，其中近20年AMI死亡率總體呈快速上升趨勢(shì)[1]。根據(jù)馬爾科夫模型預(yù)測(cè)，未來(lái)20年間中國(guó)將新增2 100萬(wàn)例急性冠狀動(dòng)脈事件，發(fā)生700萬(wàn)例心源性死亡[2]。既往大量研究表明，在常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用中藥，可有效緩解AMI病人的臨床癥狀、降低AMI病人的心源性死亡風(fēng)險(xiǎn)、改善病人心功能及生活質(zhì)量[3-5]。因此，積極探討防治AMI的有效治療藥物具有極其重要的意義。

AMI在中醫(yī)學(xué)古籍中沒(méi)有確切病名記載，但對(duì)其癥狀及治療早有論述?！端貑?wèn)·藏氣法時(shí)論》： “心病者， 胸中痛， 脅支滿， 胸背肩胛間痛， 兩臂內(nèi)痛?！薄鹅`樞·厥病》： “真心痛， 手足青至節(jié)， 心痛甚， 旦發(fā)夕死， 夕發(fā)旦死?！边@就是中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)對(duì)AMI并發(fā)休克的最早記載?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為此病與氣虛、氣滯、寒凝、血瘀、痰飲有關(guān)。漢代醫(yī)家張仲景進(jìn)行了進(jìn)一步論述，認(rèn)為其屬胸痹心痛，《金匱要略》： “胸痛徹背， 背痛徹心?！逼渌枋龅陌Y狀類似AMI發(fā)作，同時(shí)張仲景提出溫通宣痹、通陽(yáng)復(fù)脈的治療原則至今仍對(duì)臨床治療AMI有重要影響。晉隋唐時(shí)期醫(yī)家對(duì)AMI發(fā)病的認(rèn)識(shí)發(fā)展為內(nèi)虛致病論，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為病患多有內(nèi)虛的同時(shí)，兼夾瘀血、痰熱、寒邪等邪氣所客從而發(fā)病，如《諸病源候論》提出了胸痹是正虛邪盛之病。唐朝孫思邈在《千金要方》中記載的多首方劑均是在前人所用藥物基礎(chǔ)上加用辛香通散之品。而明清醫(yī)家將活血化瘀療法發(fā)揚(yáng)壯大，《醫(yī)宗金鑒》中記載的顛倒木金散、《時(shí)方歌括》中記載的丹參飲、《醫(yī)林改錯(cuò)》中的代表方劑血府逐瘀湯等， 都是采取活血化瘀法治療胸痹的代表方?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AMI是由于心脈血瘀痹阻、痰瘀互結(jié)、心失所養(yǎng)所致，治法上應(yīng)予活血化瘀、強(qiáng)心復(fù)脈，并佐以芳香開(kāi)竅、解毒化痰之品為佳[6]。靈寶護(hù)心丹(LBHX)中所含中藥大部分屬心經(jīng)，方中紅參大補(bǔ)元?dú)猓咭鏆饣钛帜苤雇?，使氣足?yáng)旺，血脈流通[7-8]；合以麝香、蟾酥加強(qiáng)了強(qiáng)心作用，能提高冠狀動(dòng)脈流量，增強(qiáng)心肌收縮功能[9]；牛黃既可清心解毒，又能解痙鎮(zhèn)痛[10]；麝香、蘇合香、冰片不但芳香開(kāi)竅，且可行氣開(kāi)郁，使瘀血痰濁，隨氣而化[11]；再配以琥珀、丹參寧心安神、養(yǎng)血活血[12]。全方組成緊密，相輔相成，共達(dá)強(qiáng)心益氣、通陽(yáng)復(fù)脈之功，更有芳香開(kāi)竅、活血鎮(zhèn)痛之用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計(jì)算生物學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)手段和內(nèi)容，能通過(guò)多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，從整體角度探索中藥與不同疾病間的關(guān)聯(lián)，為研究中藥復(fù)方提供了一種從系統(tǒng)水平尋找潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的新策略。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子模擬對(duì)接結(jié)合的方法，預(yù)測(cè)分析靈寶護(hù)心丹治療AMI的多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)展該方的實(shí)驗(yàn)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 活性化合物的收集 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)尋找靈寶護(hù)心丹中9 味中藥化學(xué)成分，根據(jù)藥物ADME參數(shù)(吸收、分布、代謝、排泄)進(jìn)行篩選，納入口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的活性化合物[13]；從中醫(yī)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(traditional Chinese medicines integrated database，TCMID)(http：//119.3.41.228：8000/tcmid/)獲得靈寶護(hù)心丹所含中藥相關(guān)活性化合物[14]；通過(guò)大規(guī)模文本挖掘獲得靈寶護(hù)心丹中所含中藥的活性化合物，所用數(shù)據(jù)庫(kù)包括PubMed、Web of Science、中國(guó)知網(wǎng)。

1.2 藥物靶標(biāo)的識(shí)別 通過(guò)人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)(https：//www.genecards.org/)獲得AMI相關(guān)基因，所選物種的條件為智人[15]。根據(jù)TCMSP和藥物數(shù)據(jù)庫(kù)(Drugbank)(https：//www.drugbank.ca/#)檢索和驗(yàn)證篩選所得化合物的作用靶標(biāo)。通過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt)(http：//www.uniprot.org/)對(duì)篩選的蛋白質(zhì)靶標(biāo)進(jìn)行名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理，取其交集靶點(diǎn)作為靈寶護(hù)心丹治療AMI的潛在作用靶標(biāo)。在此之后，將這些修訂后的靶標(biāo)導(dǎo)入蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)(String 11.0)(https：//string-db.org/)預(yù)測(cè)相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用，以獲得與AMI給定基因具有直接(物理)和間接(功能)相互作用的目標(biāo)基因。

1.3 化合物-靶標(biāo)(C-T)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?為了全面了解靈寶護(hù)心丹治療AMI的分子機(jī)制，構(gòu)建了化合物-靶標(biāo)(Compunds-Target，C-T)網(wǎng)絡(luò)。利用開(kāi)源生物信息學(xué)軟件Cytoscape 3.7.2生成并可視化該二維互作網(wǎng)絡(luò)。在此圖形網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示化合物或作用靶標(biāo)，邊代表不同節(jié)點(diǎn)之間的交互作用。隨后，對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的多個(gè)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。這些拓?fù)鋮?shù)包括度中心性(degree centrality，DC)、中間中心度(betweenness centrality，BC)、緊密中心性(closeness centrality，CC)、拓?fù)湎禂?shù)(topological coefficient，TC)。

1.4 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 通過(guò)鑒定AMI相關(guān)靶基因的生物學(xué)途徑以分析靈寶護(hù)心丹的作用機(jī)制及其藥效學(xué)作用，基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)， 采用Cytoscape軟件所含插件ClueGO +Cluepedia生成蛋白質(zhì)途徑，構(gòu)建Target-Pathway網(wǎng)絡(luò)，程序參數(shù)如下[16]：Analysis Mode： ClueGo： Functions； Load Marker List(s)：HomoSapiens[9606]；ClueGO Settings：Ontologies/Pathways：KEGG；Network Specificity：Medium。另外，將P≤0.05作為通路聚類標(biāo)準(zhǔn)。ClueGO網(wǎng)絡(luò)是根據(jù)Kappa值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)而建立的，并基于相似度反映不同條目之間的關(guān)系。在通路分析的基礎(chǔ)上，利用ClueGO軟件對(duì)多個(gè)亞組的重疊靶標(biāo)進(jìn)行生物過(guò)程(biological process，BP)分析，以探索功能相互作用。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用蛋白質(zhì)互作關(guān)系預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneMANIA)(http：//genemania.org/)構(gòu)建靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以分析其蛋白互作關(guān)系[17]。該數(shù)據(jù)庫(kù)集成了多種生物特有的功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)源，包括來(lái)自基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的共表達(dá)數(shù)據(jù)；來(lái)自蛋白質(zhì)和遺傳相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(biological general repository for interaction datasets，BioGRID)(https：//thebiogrid.org/)的物理和遺傳相互作用數(shù)據(jù)；基于蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)(Interologous Interaction Database，I2D)(http：//ophid.utoronto.ca/ophidv2.204/links.jsp)的同源蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)；來(lái)源于生物通路數(shù)據(jù)庫(kù)(pathway commons，PC)(http：//www.pathwaycommons.org/)，和人類相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(human protein reference database，HPRD)(http：//www.hprd.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)的通路和分子相互作用數(shù)據(jù)。

1.6 化合物-靶標(biāo)蛋白的分子模擬對(duì)接 利用分子對(duì)接模擬軟件Autodock Vina 1.1.2，對(duì)關(guān)鍵藥效分子與核心靶標(biāo)進(jìn)行配體-受體對(duì)接模擬計(jì)算[18]。具體流程：從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(RCSB PDB database) (https：//www.rcsb.org/)下載靶標(biāo)的3D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件PyMoL 1.7.2.1將蛋白與其配體進(jìn)行拆分，同時(shí)將去除配體后的蛋白及其分離出的配體由pdb格式轉(zhuǎn)為pdbqt格式。從有機(jī)小分子活性化合物數(shù)據(jù)庫(kù)(PubChem)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載靈寶護(hù)心丹所含核心化合物的3D結(jié)構(gòu)，利用Chem Bio Office 2014將小分子化合物由mol2格式轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。通過(guò)將蛋白及其原配體輸入分子對(duì)接輔助軟件Auto Dock Tools-1.5.6，以尋找靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)中的配體-受體對(duì)接位置，活性口袋中心被定義為40×40×40的三維網(wǎng)格，網(wǎng)格間距為0.375。利用對(duì)接主程序Autodock Vina 1.1.2將靶標(biāo)蛋白與小分子化合物進(jìn)行配體-受體分子模擬對(duì)接，根據(jù)兩者對(duì)接的最低結(jié)合能值評(píng)估靶標(biāo)蛋白與藥效分子的結(jié)合穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 靈寶護(hù)心丹化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?根據(jù)OB及DL的閾值，剔除缺乏預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的化合物，并結(jié)合多方數(shù)據(jù)庫(kù)以及既往文獻(xiàn)報(bào)道，最終篩選出104個(gè)活性化合物。其中麝香3個(gè)活性化合物，蟾酥7個(gè)活性化合物，琥珀6個(gè)活性化合物，人工牛黃5個(gè)活性化合物，冰片3個(gè)活性化合物，蘇合香3個(gè)活性化合物，丹參65個(gè)活性化合物，紅參4個(gè)活性化合物，三七8個(gè)活性化合物。利用104個(gè)活性化合物與57個(gè)疾病靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖1)，其中紅色節(jié)點(diǎn)代表丹參，淺綠色節(jié)點(diǎn)代表琥珀，紫色節(jié)點(diǎn)代表紅參，褐色節(jié)點(diǎn)代表人工牛黃，天藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表蘇合香，深綠色節(jié)點(diǎn)代表三七，深藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表麝香，粉色節(jié)點(diǎn)代表冰片，黃色節(jié)點(diǎn)代表蟾酥，橙色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。在此化合物-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)中共有161個(gè)節(jié)點(diǎn)(57個(gè)疾病靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，104個(gè)活性化合物節(jié)點(diǎn))和840條邊。每條邊代表化合物與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系。

圖1 靈寶護(hù)心丹治療AMI化合物-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape軟件中的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)溆?jì)算工具Network Analyzer對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湎禂?shù)進(jìn)行分析，degree的中位數(shù)2倍為10，BC、CC、TC的中位數(shù)分別為0.001 478 38，0.383 248 73，0.300 653 59，核心節(jié)點(diǎn)需滿足以上拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)卡值，所有節(jié)點(diǎn)分布情況見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示共有12個(gè)疾病靶點(diǎn)滿足以上卡值，列出這些核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋽?shù)值(見(jiàn)表1)，從表1中可見(jiàn)各靶點(diǎn)的degree值，叉頭轉(zhuǎn)錄因子[Forkhead box protein O1(FoxO1)，77]；沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1，Sirt1，72)；Caspase-3(CASP3)，65；Interleukin-6(IL-6)，57；RAC-alpha serine/threonine-protein kinase(AKT1)，55；Superoxide dismutase[Mn](SOD2)，54；Bcl2-associated agonist of cell death(Bcl2)，46；Apoptosis regulator Bax(Bax)，39；Signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)，27；matrix metalloproteinase-9(MMP-9)，17；mitogen-activated protein kinase 1(MAPK1)，16；SLC2A4 regulator(SLC2A4)，12。

表1 靈寶護(hù)心丹治療AMI化合物-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

通過(guò)對(duì)C-T網(wǎng)絡(luò)中代表活性化合物的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，可以挖掘出靈寶護(hù)心丹中相對(duì)重要的活性化合物，并列出所有化合物的OB及DL值(見(jiàn)表2)。這些degree值高的靶點(diǎn)和化合物可能在靈寶護(hù)心丹治療AMI的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖2 靈寶護(hù)心丹治療AMI化合物-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分布情況

表2 靈寶護(hù)心丹所含活性化合物信息

(續(xù)表)

(續(xù)表)

2.2 靶點(diǎn)生物功能及靶點(diǎn)-通路分析 使用ClueGO KEGG通路富集功能對(duì)57個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)分析以探索其靶基因功能。結(jié)果表明57個(gè)靶基因被定位到111個(gè)通路上，并且被分類為16個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的亞組。這些亞組中的基因主要被富集于以下通路：Viral myocarditis(KEGG：05416)，F(xiàn)luid shear stress and atherosclerosis(KEGG：05418)，Leukocyte transendothelial migration(KEGG：04670)，Longevity regulating pathway (KEGG：04211)，p53 signaling pathway(KEGG：04115)，HIF-1 signaling pathway(KEGG：04066)，F(xiàn)oxO signaling pathway(KEGG：04068)，Apoptosis(KEGG：04215)，Measles(KEGG：05162)，Pancreatic cancer(KEGG：05212)，Relaxin signaling pathway(KEGG：04926)，NF-kappa B signaling pathway(KEGG：04064)，Chronic myeloid leukemia(KEGG：05220)，Pertussis(KEGG：05133)，Human papillomavirus infection(KEGG：05165)，Necroptosis(KEGG：04217)。詳見(jiàn)圖3。通過(guò)對(duì)各亞組中所富集的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上述C-T網(wǎng)絡(luò)中的12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因在不同亞組中亦具有重疊，表明這些基因在通路網(wǎng)絡(luò)中也扮演重要作用。因此，運(yùn)用ClueGO BP分析功能對(duì)這些基因進(jìn)行生物過(guò)程富集分析，以探索它們之間的功能相互作用(見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明這些基因富集出73個(gè)條目，主要包括以下生物學(xué)過(guò)程：cellular response to cadmium ion(GO：0071276)，leukocyte homeostasis(GO：0001776)，negative regulation of oxidative stress-induced intrinsic apoptotic signaling pathway(GO：1902176)，leukocyte apoptotic process(GO：0071887)，apoptotic mitochondrial changes(GO：0008637)，leukocyte apoptotic process(GO：0071887)，regulation of oxidative stress-induced cell death(GO：1903201)。

圖3 57個(gè)關(guān)鍵疾病靶點(diǎn)ClueGO KEGG通路富集

圖4 12個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的生物學(xué)過(guò)程亞組分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 利用Cytoscape插件GeneMANIA將12個(gè)關(guān)鍵基因構(gòu)建可視化的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中共包括32個(gè)基因節(jié)點(diǎn)(見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明這些基因間的相互作用關(guān)系類型主要為以下幾種：Pathway占38.15%，Predicted占31.49%，Co-expression占15.01%，Physical Interactions占9.45%，Co-localization占3.1%，Shared protein domains占2.78%。并列出由這12個(gè)關(guān)鍵基因具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前20個(gè)重要生物學(xué)功能，包括cellular response to peptide hormone stimulus(GO：0071375)，response to peptide hormone(GO：0043434)，cellular response to peptide(GO：1901653)，response to peptide(GO：1901652)，neurotrophin TRK receptor signaling pathway(GO：0048011)，neurotrophin signaling pathway(GO：0038179)，regulation of cellular response to stress(GO：0080135)，intrinsic apoptotic signaling pathway(GO：0097193)。詳見(jiàn)表3。

圖5 12個(gè)關(guān)鍵基因構(gòu)建的蛋白靶點(diǎn)PPI互作網(wǎng)絡(luò)

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)功能分析

2.4 分子對(duì)接模擬 對(duì)靈寶護(hù)心丹中的核心活性化合物和C-T網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行配體-受體分子對(duì)接模擬，以最低結(jié)合能評(píng)估化合物與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性，結(jié)合能越小表明二者結(jié)合的穩(wěn)定性越好。結(jié)果顯示，3個(gè)核心活性化合物與核心靶標(biāo)蛋白Sirt1、FoxO1、CASP3的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，表明這些化合物與以上蛋白結(jié)合較穩(wěn)定。詳見(jiàn)圖6。

圖6 關(guān)鍵活性化合物與核心靶點(diǎn)蛋白分子模擬對(duì)接

3 討 論

靈寶護(hù)心丹具有強(qiáng)心益氣、通陽(yáng)復(fù)脈、芳香開(kāi)竅、活血鎮(zhèn)痛之功效，臨床用于冠心病心絞痛及氣虛血瘀所致的胸痹，癥見(jiàn)胸悶氣短、心前區(qū)疼痛、脈結(jié)代者，具有良好的臨床療效。本研究基于生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞牟呗裕A(yù)測(cè)靈寶護(hù)心丹治療AMI的靶點(diǎn)，探索靈寶護(hù)心丹治療AMI的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步研究靈寶護(hù)心丹的療效作用提供科學(xué)依據(jù)。

3.1 靈寶護(hù)心丹治療AMI的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)及其生物學(xué)功能分析 鑒定與疾病發(fā)生有關(guān)的重要靶蛋白對(duì)于探索靈寶護(hù)心丹治療AMI的分子機(jī)制至關(guān)重要，對(duì)此本研究構(gòu)建了化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的多個(gè)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析以篩選出關(guān)鍵作用靶標(biāo)。該網(wǎng)絡(luò)包含161個(gè)節(jié)點(diǎn)和840條邊，通過(guò)計(jì)算所有節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)獲得了12個(gè)關(guān)鍵基因，包括FoxO1、Sirt1、CASP3、IL-6、AKT1、SOD2、Bcl2、Bax、STAT3、MMP9、MAPK1、SLC2A4。同時(shí)，通過(guò)對(duì)所有基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在KEGG富集網(wǎng)絡(luò)中的不同亞組間具有重疊性，這證明這些基因在C-T網(wǎng)絡(luò)以及通路網(wǎng)絡(luò)中同時(shí)承擔(dān)了關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的作用。根據(jù)基因功能分類，結(jié)果顯示靈寶護(hù)心丹的藥效作用可影響多種AMI的病理過(guò)程，不僅集中在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡上(FoxO1、Sirt1、CASP3、SOD2、Bcl2、Bax)，同時(shí)對(duì)炎癥反應(yīng)亦有調(diào)節(jié)作用(IL-6、AKT1、STAT3、MMP9、MAPK1、SLC2A4)。 Sirt1是NAD+依賴性蛋白脫乙酰酶，在細(xì)胞分化、衰老、凋亡、生理節(jié)律、代謝調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激等多種重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19]。過(guò)往有急性心肌缺血和缺血預(yù)處理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Sirt1通過(guò)抗氧化、抗炎、減少凋亡等機(jī)制發(fā)揮心肌保護(hù)作用[20]。FoxO1是Sirt1的下游底物，Sirt1通過(guò)使FoxO1去乙?；瘡亩碳て浣閷?dǎo)的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的基因表達(dá)，已有研究表明Sirt1通過(guò)FoxO1刺激轉(zhuǎn)錄，并增強(qiáng)損傷/修復(fù)(I/R)誘導(dǎo)的FoxO1在心臟的核定位[21]。FoxO1轉(zhuǎn)錄因子屬于FoxO家族成員，主要參與細(xì)胞凋亡、應(yīng)激、DNA損傷/修復(fù)、腫瘤發(fā)生、血管生成和糖代謝等生命過(guò)程。Sirt1可通過(guò)激活FoxO1對(duì)SOD2、Bax等下游細(xì)胞因子起到調(diào)控作用[22]。炎癥反應(yīng)是心肌梗死后心室重構(gòu)、心功能惡化的重要誘因之一，可進(jìn)一步引發(fā)血管功能失調(diào)、細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等病理改變。心肌梗死后，由于組織缺血缺氧、室壁張力增加等引發(fā)心肌組織壞死并釋放抗原性物質(zhì)、黏附分子、補(bǔ)體、激肽等多種炎癥介質(zhì)引發(fā)急性炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞趨化，并聚集于梗死部位，釋放白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)等多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的形成以清除壞死細(xì)胞，并促進(jìn)壞死組織的吸收和損傷組織的修復(fù)[23]。

3.2 靈寶護(hù)心丹治療AMI的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 本研究基于kappa分析對(duì)57個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建KEGG功能分組網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的16個(gè)功能亞組分析發(fā)現(xiàn)，其中涉及多個(gè)與AMI病理過(guò)程相關(guān)的信號(hào)通路，包括缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路。

3.2.1 NF-κB信號(hào)通路 NF-κB是心臟應(yīng)激反應(yīng)快速表達(dá)基因，當(dāng)細(xì)胞受到活性氧(ROS)等外界因素刺激時(shí)，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活蛋白激酶，致使胞漿中的NF-κB三聚體復(fù)合物中的IκB的活化，迅速發(fā)生核易位，與特異性κB序列結(jié)合而啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄， 參與包括炎癥、凋亡在內(nèi)的多種生物學(xué)反應(yīng)[24]。Na等[25]發(fā)現(xiàn)藤黃可以降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、ICAM-1、IL-6和TNF-α在心肌梗死大鼠中表達(dá)水平，其機(jī)制可能與抑制NF-κB/p38途徑的激活有關(guān)。

3.2.2 HIF-1信號(hào)通路 HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，在許多動(dòng)物物種中均起著主要氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器的作用。 HIF-1通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成和血管重塑來(lái)控制氧氣的輸送，并通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)來(lái)控制氧氣的利用[26]。動(dòng)物模型分析表明，通過(guò)激活這些穩(wěn)態(tài)機(jī)制，HIF-1信號(hào)通路在缺血性心臟病和壓力超負(fù)荷心力衰竭的病理生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的保護(hù)作用[27]。Yu 等[28]研究了阿托伐他汀聯(lián)合常規(guī)治療對(duì)AMI大鼠HIF-1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響及其治療效果，結(jié)果表明阿托伐他汀聯(lián)合常規(guī)治療相比單一常規(guī)治療能更好地降低大鼠血清HIF-1和VEGF水平，從而改善左心室功能。

3.2.3 FoxO信號(hào)通路 FoxO1是一種主要位于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)翻譯后修飾，包括磷酸化、乙?；⒎核鼗榷喾N途徑調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá)，從而參與凋亡、自噬、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和代謝失調(diào)等多種生理病理過(guò)程[29]。Zhao等[30]研究觀察到利用lncRNA MEG3模擬物轉(zhuǎn)染低氧心肌細(xì)胞后，可以顯著增加低氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞中的FoxO1表達(dá)量，抑制心肌細(xì)胞的增殖速率，加速心肌細(xì)胞的凋亡速率。Qiu等[31]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用si-RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)的H9c2心肌缺氧細(xì)胞中，miR-370可通過(guò)靶向FoxO1抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。

3.3 靈寶護(hù)心丹所含關(guān)鍵活性化合物及其藥理學(xué)作用 通過(guò)對(duì)化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中活性化合物節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素(degree為39)、β-谷甾醇(degree為37)、丹參酮ⅡA(degree為31)的degree值排名靠前，證明其在化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。結(jié)合分子模擬對(duì)接的結(jié)果，槲皮素、β-谷甾醇、丹參酮ⅡA與核心靶標(biāo)蛋白Sirt1、FoxO1、CASP3的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol，表明這些化合物與以上蛋白結(jié)合較穩(wěn)定。槲皮素是一種類黃酮，具有抗氧化活性，具有心肌保護(hù)作用。Chen等[32]研究報(bào)道使用槲皮素預(yù)處理可降低原代心肌細(xì)胞中乳酸脫氫酶的含量和Caspase-3活性，降低丙二醛含量和ROS水平，并且減少凋亡細(xì)胞的百分比，同時(shí)發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用pAD/14-3-3γ-shRNA抑制14-3-3γ表達(dá)，則將削弱上述心臟保護(hù)作用，這證明槲皮素可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激并通過(guò)14-3-3γ改善線粒體功能來(lái)保護(hù)心肌細(xì)胞。丹參酮ⅡA是一種二萜醌類化合物，具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。Wei等[33]研究證明丹參酮ⅡA磺酸鈉可以通過(guò)干預(yù)ERK(1/2)/Nrf2/HO-1/AMPK/ACC/CPT1通路，上調(diào)抗氧化系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達(dá)，改善心肌梗死大鼠的心臟功能障礙和心肌酶譜的變化，發(fā)揮心肌梗死大鼠的心臟保護(hù)作用。β-谷甾醇是一種植物甾醇類成分，可影響多種細(xì)胞信號(hào)通路，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、血管生成炎癥。Wong等[34]實(shí)驗(yàn)證明β-谷甾醇可刺激H9c2心肌細(xì)胞線粒體的ATP生成能力，增加細(xì)胞谷胱甘肽氧化還原循環(huán)反應(yīng)，抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡反應(yīng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在心肌缺血/再灌注損傷大鼠中β-谷甾醇可能通過(guò)上調(diào)線粒體谷胱甘肽氧化還原循環(huán)發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了靈寶護(hù)心丹治療AMI的潛在分子機(jī)制，靈寶護(hù)心丹由9味藥物組成，其含有的多種活性化合物通過(guò)作用于不同靶標(biāo)蛋白、不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮對(duì)AMI的治療作用，體現(xiàn)了中藥復(fù)方協(xié)同性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈寶護(hù)心丹可能通過(guò)以下途徑發(fā)揮其治療作用：①作用于FoxO1信號(hào)通路，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激作用誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，控制線粒體損傷，減少ROS的產(chǎn)生，從而發(fā)揮對(duì)缺血心肌細(xì)胞的保護(hù)作用；②作用于NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、 IL-1β、ICAM-1等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，減少心肌梗死后由于組織缺血缺氧、室壁張力增加等引發(fā)的心肌組織壞死，抑制急性炎癥反應(yīng)，挽救缺血心肌組織。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及結(jié)合分子模擬對(duì)接的方法，預(yù)測(cè)了靈寶護(hù)心丹治療AMI的相關(guān)信號(hào)通路，為后續(xù)的療效機(jī)制研究提供了依據(jù)和方向。