Hath1基因在增生性息肉與鋸齒狀腺瘤/息肉中的表達及鑒別意義①

尹 源，鄭知強，謝 銳，林凡榆，梁 龍

（1成都三六三醫(yī)院消化內科，2四川省腫瘤醫(yī)院腫瘤科，成都610041）

無蒂鋸齒狀腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)好發(fā)于右側結腸，是結直腸癌的前驅病變之一[1]。其內鏡下表現為柔軟光滑，扁平無蒂，表面蒼白，通常覆有黏液，往往邊界不清[2]。根據世界衛(wèi)生組織（WHO）提出的第4版《消化系統(tǒng)腫瘤分類》，SSA/P出現不典型增生或癌變時，可能表現出蒂生長、發(fā)紅、中央凹陷等特征[3]。但在疾病早期或進展隱匿時，限于鏡頭方位、病灶大小或其他偽影，僅憑內鏡檢查鑒別增生性息肉(hyperplastic polyp,HP)與SSA/P的難度較大，尤其在病變位于左半結腸時，HP結腸黏膜的脫垂與SSA/P的形態(tài)容易混淆[4]。但是HP和SSA/P在癌變風險、治療方案和隨訪策略等方面顯著不同[5]。因此尋找一種具有高特異性和敏感性的生物標志物輔助形態(tài)學進行判斷將有望提高診治的準確性，然而目前尚缺乏高效率的理想標記物[6]。Notch信號在腸道發(fā)育和內穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，有研究發(fā)現Hath1在人和小鼠腸上皮細胞核中均有表達，其表達水平會受到Notch信號通路中Hes1基因的抑制，并可以通過調節(jié)腸細胞的分化而影響腸道發(fā)育[7]。本研究比較了Hath1基因在HP和SSA/P中表達，從而探究其在二者鑒別診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4月—2019年12月在成都三六三醫(yī)院接受內鏡及病理檢查的患者作為研究對象，調取其病理診斷電子管理系統(tǒng)中相關資料。所有病例閱片由3名相同的病理專家獨立進行，當診斷一致時即納入本次研究。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)既往未接受全結腸鏡檢查；(3)病理診斷為鋸齒狀息肉或傳統(tǒng)腺瘤。排除標準：(1)合并炎癥性腸病；(2)合并遺傳性的腸道疾病，如增生性息肉綜合征、遺傳性非息肉性結腸癌、家族性腺瘤性息肉病等；(3)合并有其他系統(tǒng)的惡性腫瘤；(4)既往接受過腸道手術；(5)數據缺失，相關臨床資料不全。納入本次研究的患者共計92例，其中HP組31例，男性19例，女性12例，年齡35～79歲，平均年齡(61.3±5.1)歲；10例病變位于右半結腸，21例病變位于左半結腸；粘蛋白分布亞型包括2類，其中5例杯狀細胞型鋸齒狀息肉，26例微泡狀黏蛋白型鋸齒狀息肉，未發(fā)現黏蛋白缺失型息肉。SSA/P組患者61例，男性34例，女性27例，年齡36～75歲，平均年齡(59.1±6.2)歲，45例病變位于右半結腸，16例病變位于左半結腸。此外還收集了4例SSA/P伴異型增生患者，17例傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤（TSA）患者，11例管狀腺瘤（TA）患者，以及20例正常的結直腸組織作為對照組，對比分析Hath1在不同病變中的免疫組化染色特征。

1.2 不同病變的病理學特征（1）HP組織：①多位于直腸或遠端結腸，鏡下呈水滴珍珠色，形態(tài)扁平輕微隆起；②細胞排列整齊，總體靠基底側；③細胞核形態(tài)一致，體積偏?。虎茈[窩長、直，典型鋸齒狀結構占表面1/2以上，基底狹窄，多為非鋸齒狀結構；⑤覆蓋有杯狀上皮及柱狀上皮；⑥無明顯的結構異常及不典型細胞。（2）SSA/P組織：①組織異形：具有明顯的深隱窩鋸齒，畸形隱窩緊貼黏膜肌層橫向生長，呈燒杯底狀、L型或倒T型；②細胞異型：癌變風險高，常出現上皮異常增殖，但細胞、結構學改變達不到低級別惡變；③病灶直徑5～9 mm，常見于右半結腸發(fā)病。（3）傳統(tǒng)TSA組織：①細胞、結構改變符合低級別惡變標準，但黏膜與畸形的隱窩不相鄰，且異型增生位于隱窩上1/2；②病灶隆起、有蒂，表面呈腦回狀，多發(fā)于左半結腸。（4）TA組織：①表面光滑，包膜完整。剖面呈棕黃色，散布大小不均的含粘液囊腔；②由雙層排列的立方或柱狀上皮細胞組成，互相吻合成狹長的小梁狀或不規(guī)則的小管狀；③胞漿嗜酸性，細胞核呈卵圓形，體積偏大，大小均一；④間質與實質間有基底膜分隔，間質疏松，其中有大量小靜脈和毛細血管。小梁外周或管腔沒有上皮細胞，管腔內分泌物糖原染色（PAS）陽性。

1.3 Hath1免疫組化染色 Hath1在組織標本中的表達通過免疫組化方法進行檢測。組織切片先依次于二甲苯及梯度乙醇中脫蠟，再利用熱效應修復抗原，封閉采用0.3%過氧化氫，阻斷采用血清進行孵育。一抗為購自Millipore Chemicon公司的Hath1兔單克隆抗體（AB5692），孵育24 h。之后以二抗（生物素標記）和親和素（辣根過氧化物酶標記）與樣品孵育，以二氨基聯(lián)苯胺（DAB）法染色。染色結果由兩名經驗豐富的研究者獨立評估。染色強度采用半定量法分4級：3級(強染色)、2級(中度染色)、1級(弱染色)、0級(無染色)。陽性細胞百分率分為4級：3分(＞50%)、2分(31%～50%)、1分(1%～30%)、0分(0%)?？傮w染色陽性的判定：總積分=強度分數×陽性百分率分數，＞2分記為“陽性”、0～2分記為“陰性”。

1.4 統(tǒng)計學分析 利用SPSS 25.0軟件分析數據。計數資料以例（%）表示，Hath1在HP和SSA/P中的表達率差異用Fisher精確檢驗(雙尾)比較。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常組織和HP中Hath1的表達 在正常結腸黏膜中，Hath1染色見于固有層的間質性炎癥細胞、隱窩細胞和上皮細胞的細胞核，染色強度一致(圖1A、1B)。以間質炎癥細胞的強度為染色陽性標準。在HP組織中，Hath1在微泡(26/26,100%，圖1C～1F)和杯狀細胞(5/5,100%，圖1G、1H)的隱窩內均有與正常結腸黏膜強度一致核染色。

圖1 Hath1在正常結腸黏膜和增生性息肉中的表達

2.2 SSA/P和SSA/P伴異型增生中Hath1的表達在SSA/P組織中，56例（91.8%）隱窩細胞核Hath1染色非常微弱或缺失(圖2A～2F)，5例（8.2%）隱窩細胞核Hath1染色陽性的組織均來自左側（直腸3例，乙狀結腸2例）。Hath1染色陽性率在息肉部位（χ2=31.452）或者SSA/P及HP（χ2=53.157）中的差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），見表1。進一步由表2計算得出，以Hath1表達缺失為標準鑒別HP和SSA/P的敏感性為91.81%，特異性為100%。而在所有伴異型增生的SSA/P組織中，可觀察到Hath1有不同的染色表現，往往在發(fā)育不良的上皮細胞質中呈現彌漫性的陽性染色(圖2G～2H)。

表1 HP和SSA/P組織在不同病灶定位中的Hath1染色陽性率比較

表2 Hath1表達降低與病理診斷結果的關系

圖2 Hath1在SSA/P和SSA伴異型增生中的表達

2.3 HP黏膜脫垂組織中Hath1的表達 染色結果顯示，在HP黏膜脫垂的扭曲隱窩中Hath1的核表達與正常組織和HP組織保持一致。見圖3。

2.4 TSA和TA中Hath1的表達 在TA中，Hath1表達為大部分的強陽性的核染色，同時伴有部分斑片狀陰性表達(圖4A、4B)。在TSA中，Hath1表達呈混合模式，同時有局灶性的表達缺失和強陽性核染色(圖4C、4D)。

圖3 Hath1在HP黏膜脫垂中的表達

圖4 Hath1在管狀腺瘤和傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤中的表達

3 討論

SSA/P最早由Torlakovic等[8]報道，多為發(fā)生于結直腸的鋸齒狀息肉，外表類似于HP，但是組織構造差異較大。依照WHO的建議，這一類型的息肉現被命名為無蒂鋸齒狀腺瘤/息肉[9]。SSA/P具有惡變傾向，是右半結直腸癌的高危因素，并且進展較快，約有30%的結直腸癌繼發(fā)于SSA/P[10]。因此早期識別和科學干預是阻止不良預后的關鍵。但明確SSA/P的診斷較為困難，往往需要形態(tài)學與分子學的聯(lián)合應用。

Hath1是一種轉錄因子，它能抑制結腸癌細胞的增殖，其在組織中的缺失可能意味著惡變潛能的提高[11]。與Zhu等[12]的報道一致，本研究證實了Hathl基因表達于正常腸黏膜組織中的細胞核。進一步探究其在不同病變組織中的表達情況，結果顯示在SSA/P組織中Hathl的表達陽性率明顯低于HP組織（P＜0.05）。與病理檢查這一金標準結果進行比較，以Hath1表達缺失為標準鑒別HP和SSA/P的敏感度為91.80%，特異度為100%，具有較高的輔助診斷意義。

此外，在本組資料中還存在部分位于左半結腸的息肉具有與SSA/P一致的形態(tài)，但仍然存在較強的陽性核染色?？紤]其原因主要是：（1）右側的SSA/P通常顯示Hath1的均勻丟失，而左側的SSA/P可以維持Hath1的表達，這可能與表觀遺傳特征差異有關。（2）左側息肉鏡檢時難度較大，還可能出現鏡下偽影等各種因素，因此難以與SSA/P明確區(qū)分，存在一定觀察偏倚。

本研究結果提示，在形態(tài)學上SSA/P與伴黏膜脫垂的HP更加容易混淆，但是伴黏膜脫垂的HP中Hath1的核染色在扭曲的隱窩中也依然保持不變，可為鑒別診斷提供參考。在SSA/P發(fā)育不良的上皮中，本研究在細胞質中觀察到彌漫性的Hath1陽性染色，這提示Hath1的位置發(fā)生了變化，這可能是Hath1信號通路失調導致的[14]。而TA和TSA作為重要的惡性腫瘤先兆，既往有研究顯示，Hath1往往會在TA組織中表達上調[13]。而在本研究中，TA中Hath1表達為大部分的強陽性的核染色，同時伴有部分斑片狀陰性表達。由于在固有層炎癥細胞中Hath1也能夠表現出均勻且強度較大的染色，因此這種混合染色模式為偽影的可能性很小，可能是TA的表觀遺傳多樣性所致的差異。而T SA也是一類具有較強遺傳異質性的疾病[15]，在本研究中同樣表現出了混合模式，即同時存在局灶性的表達缺失和強陽性核染色。

由于能夠明確診斷的病例數相對較少，因此本研究樣本量偏低，存在一定局限性。下一步將適當納入更多符合標準的病例，從而為指導臨床工作提供可靠依據。

綜上所述，本研究發(fā)現，在SSA/P中Hath1的表達可能較正常結腸黏膜或HP組織減弱甚至完全消失；在伴有異常增生的SSA/P上皮中，Hath1彌漫性表達于胞漿；TA和TSA組織中則顯示出與上述表現不同的混合染色模式。而Hath1的表達缺失鑒別HP與SSA/P具有較高的靈敏度和特異性，有望成為輔助診斷SSA/P的重要標記物。