三羥基咔咯及其鎵配合物(-Ga)在新型抗腫瘤藥物研發(fā)中的應用及對人肺癌細胞(A549)增殖的影響①

張 靜，趙 天，丁亞楠，趙曉飛

（1邢臺市第三醫(yī)院藥劑科，河北邢臺054000；2邢臺醫(yī)學高等專科學校第二附屬醫(yī)院臨床藥學科，河北邢臺054000）

癌癥是現(xiàn)代醫(yī)學上尚未攻克的重大難題，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)安全有效的新型抗腫瘤藥物是醫(yī)藥學界的不懈追求。卟啉類化合物不僅在生物和材料化學領域發(fā)揮重要作用，且有研究證實卟啉是一種具有巨大開發(fā)潛力的抗腫瘤藥物[1]。咔咯（Corrole）是人工合成的一種類卟啉大環(huán)化合物，其結構上含有18-π電子的共軛結構，能夠與金屬離子發(fā)生結合生成具有高穩(wěn)定性的金屬配合物，而咔咯及其金屬配合物的抗腫瘤效果已得到初步證實[2]。近來研究表明咔咯及其金屬配合物抗腫瘤作用發(fā)揮主要與卡洛及金屬配合物表現(xiàn)出的獨特光物理特性有關，其可以發(fā)揮光核酸酶活性并與DNA鏈之間產生非共價結合，從而導致DNA鏈發(fā)生斷裂[3]。目前咔咯及其配合物的研究主要集中于鐵、鈷等配合物，關于中心金屬為鎵的咔咯配合物研究較少；而近來研究發(fā)現(xiàn)已鎵或磷作為中心金屬的咔咯配合物可以在光照條件下發(fā)揮出質粒DNA斷裂功效，并具備化學核酸酶活性。因此探討高效低毒的咔咯配合物對進一步開拓大環(huán)類新型抗腫瘤化合物具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肺癌細胞(A549)株購自上海匹拓生物科技有限公司，品牌為美國Scien Cel。

1.1.2 儀器和試劑 旋轉蒸發(fā)儀（廠家：常州市國旺儀器制造有限公司，型號：RE501）；高速冷凍離心機（德國SIGMA，型號1-14K）；低速離心機（廠家：上海安亭，型號：TDL-50）；流式細胞儀（廠家：Beckman Coulter，型號：Gallios）；熒光顯微鏡（廠家：德國萊卡公司，型號：DMi8）；CO2細胞培養(yǎng)箱（廠家：上海力申科學儀器有限公司，型號：HFI60W）；紫外分光光度計（型號：安捷倫；型號：Cary 3500）；實時熒光定量PCR儀（廠家：美國Bio-Rad，型號：CFX86）；酶標儀（廠家：美國Bio-Rad，型號：CFX86）。線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自Abcam公司；胰酶、胎牛血清、青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma；PBS購自武漢博士德。

1.2 方法

1.2.1 配合物的合成 將73 mg 10-（4-羥基苯基）-5,15-二（五氟苯基）咔咯以及2,2'-二羥基二乙胺400 μL分別加入25 mL圓底燒瓶中，采用4 mL無水二甲基亞砜將反應物充分溶解；然后放置于磁力攪拌器以500 r/min進行回流，2 h后停止反應。經柱層析法去除雜質和純化后重結晶，得到目標產物三羥基咔咯（咔咯1）。取60 mg咔咯1置于25 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無水吡啶充分將其溶解，迅速加入過量氯化鎵（約100 mg）進行化學反應；加氮氣保護，置于磁力攪拌器以500 r/min回流1.5 h后停止。經柱層析法分離去除雜質后重結晶，得到目標產物鎵配合物（1-Ga）。

1.2.2 噻唑藍比色法（MTT）將A549細胞培養(yǎng)板繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱進行細胞貼壁生長24 h，將A549細胞分為3組，分別為對照組、咔咯1組和1-Ga組。具體為對照組將原有培養(yǎng)基更換原有的新鮮培養(yǎng)基，咔咯1組和1-Ga組將原有培養(yǎng)基更換為咔咯1和1-Ga培養(yǎng)基（濃度為1.5～100μmol/L）。待繼續(xù)孵育4 h后，3組分別在光照和黑暗下進行培養(yǎng)，其中光照置于625 nm紅光下光照1 h，黑暗則置于避光的黑暗條件下，隨后均繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后將所有培養(yǎng)板去除后棄取原有培養(yǎng)基，加入10μL MTT溶液/孔，再加入90μL新鮮培養(yǎng)基/孔繼續(xù)孵育4 h。再取出將含有MTT培養(yǎng)基去除，更換成100μL DMSO，然后放置于搖床中，待結晶產物溶解后使用酶標儀測定470 nm波長處光密度值（OD470）。并使用Graphpad Prism7.0對數(shù)據(jù)進行處理，得到目標化合物的半數(shù)最大抑制濃度值（IC50）值。OD值越大表示細胞活性越強即化合物毒性越小。其中細胞存活率=（含藥實驗組OD/對照組OD）×100%[4]。

1.2.3 細胞形態(tài)觀察 待A549細胞完成過夜貼壁生長后，將原有培養(yǎng)基棄去，對照組更換新鮮培養(yǎng)基，咔咯1組和1-Ga組分別更換為濃度為3μmol/L的咔咯1和1-Ga培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后將其取出置于625 nm紅光下光照1 h，然后繼續(xù)孵育12 h。使用PBS溶液沖洗2遍后于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.4 線粒體膜電勢的變化 待A549細胞完成過夜貼壁生長后，將原有的培養(yǎng)基棄取，對照組更換新鮮培養(yǎng)基，咔咯1組和1-Ga組分別更換為濃度為3 μmol/L的咔咯1和1-Ga培養(yǎng)基，另外單獨設置一組在對照組基礎上加入適量具有誘導細胞凋亡作用的羰基氰3-氯苯腙（CCCP）作為陽性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后將其取出置于625 nm紅光下光照1 h，然后繼續(xù)孵育12 h。使用PBS溶液沖洗2遍后，于每孔中加入稀釋后的線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)染色工作液約1 mL。然后對其進行避光20 min處理，再次使用JC-1染色緩沖液沖洗兩次后補充2 mL培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡下觀察細胞線粒體膜電勢的變化。

1.2.5 咔咯1、1-Ga抑制異種移植斑馬魚模型中A549細胞生長和轉移影響 將正常受精后的轉基因熒光斑馬魚放置于培養(yǎng)皿中，然后加入鏈蛋白酶溶液，隨后將斑馬魚隨機分配于6孔板中，將Dil標記的A549細胞（紅色）顯微注射入斑馬魚胚胎中以構建腫瘤斑馬魚模型，并使用3μmol/L的咔咯1和1-Ga連續(xù)處理72 h，該階段置于28.5℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育，然后將斑馬魚洗凈轉移至96孔板中，放置于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚A549細胞生長和轉移影響，并進行拍照。

1.2.6 流式細胞儀檢測A549細胞凋亡及細胞周期將CO2培養(yǎng)箱中的處于對數(shù)期生長的A549細胞取出，待細胞完成過夜貼壁生長后，將原有的培養(yǎng)基棄取，對照組更換新鮮培養(yǎng)基，另外兩組分別更換為濃度為3μmol/L的咔咯1和1-Ga培養(yǎng)基，棄去孔板里的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后將其取出置于625 nm紅光下光照1 h，然后繼續(xù)孵育12 h。使用PBS溶液沖洗兩遍后，于每孔中加入經稀釋后胰酶溶液（濃度0.25%）對細胞進行消化30 s。然后離心5 min（離心速度1000 r/min）后將細胞沉淀收集。使用PBS溶液沖洗兩遍后加入碘化丙啶染色液染色，待完成充分重懸后將其置于37℃條件下進行避光孵育30 min，使用流式細胞儀對細胞凋亡情況檢測，并采用Modfit軟件進行細胞周期分析。

2 結果

2.1 體外細胞毒性 咔咯1組和1-Ga組均對A549、MCF-7、HepG2 3種腫瘤細胞存在光毒性和暗毒性，且在光照條件下的半抑制率（Half inhibition rate，IC50）遠小于黑暗條件下半抑制率（P＜0.05）。光照條件下1-Ga對MCF-7、A549腫瘤細胞以及黑暗條件下1-Ga對MCF-7、HepG2、A549腫瘤細胞的IC50小于咔咯1（P＜0.05）。見表1。

表1咔咯1和1-Ga對A549、MCF-7、Hep G2細胞的體外細胞毒性（-x±s，μmol/L）

2.2 細胞形態(tài)學觀察光照條件下咔咯1和1-Ga均能抑制A549細胞增殖。相較于對照組，咔咯1組和1-Ga組均對A549細胞的外觀形態(tài)產生明顯影響：多邊形梭型貼壁細胞由密集狀態(tài)轉變成圓形卷曲狀態(tài)，且細胞密度明顯降低且出現(xiàn)細胞碎片和細胞死亡；且1-Ga處理的細胞形態(tài)學變化更顯著，見圖1。

圖1光照條件下咔咯1和1-Ga對A549細胞的形態(tài)學影響

2.3 線粒體膜電勢檢測對照組A549腫瘤細胞呈現(xiàn)強烈紅色熒光，線粒體膜電勢處于正常水平；光照條件下使用咔咯1和1-Ga處理后的A549腫瘤細胞線粒體膜電勢下降，誘導細胞發(fā)生凋亡且呈現(xiàn)綠色熒光，見圖2。

2.4 咔咯1、1-Ga抑制異種移植斑馬魚模型中A549細胞生長和轉移影響對照組在未進行任何藥物干預下，72 h時經Dil標記的紅色A549細胞在斑馬魚中顯著增殖并向尾部轉移；分別加入咔咯1、1-Ga干預處理72 h，紅色熒光的A549細胞轉移程度明顯降低，且1-Ga組A549細胞轉移程度相比咔咯1組更低。見圖3。

圖2咔咯和1-Ga對A549細胞線粒體膜電位影響

圖3咔咯1、1-Ga抑制異種移植斑馬魚模型中A549細胞生長和轉移影響

2.5 咔咯1、1-Ga對細胞周期和凋亡情況的影響對 照組A549細胞大部分位于G0/G1期，經咔咯1、1-Ga作用后，咔咯1組A549細胞S期比例變化不大，1-Ga組A549細胞S期比例明顯降低（P＜0.05）；且對照組中99%以上的A549細胞存活，咔咯1、1-Ga處理過后的A549細胞存活比例均下降，分別為90.9%、49.9%，且觀察到經咔咯1、1-Ga處理過后的早期凋亡細胞比例分別為4.2%和45.0%，晚期凋亡細胞比例分別為3.2%和47%；且1-Ga組細胞凋亡比例顯著高于咔咯1組（P＜0.05）。見圖4～5。

圖4流式細胞術分析咔咯1、1-Ga對A549細胞細胞周期分布影響

圖5流式細胞雙染分析咔咯1和1-Ga對A549細胞凋亡影響

3 討論

卟啉類化合物是一種光動力抗腫瘤藥物，咔咯化合物因與卟啉化合物具有相似的大環(huán)共軛結構，其在抗腫瘤領域中的作用逐漸凸顯[5]。以往合成咔咯配合物主要采取金屬離子模板法，但得到的金屬配合物種類有限，如鈷咔咯配合物。通過合成方法的逐漸改良和優(yōu)化，目前主要合成方法是先合成自由咔咯，再加入過量離子鹽于有機溶劑中反應獲得對應配合物[6]。本文通過采用第二種合成方法，將5,15-二（五氟苯基）-10-（4-羥基苯基）咔咯化合物與2,2'-二羥基二乙胺親核試劑發(fā)生取代反應以合成得到meso位上含有2個乙羥基和一個苯羥基的新咔咯1化合物，然后通過加入過量氯化鎵形成金屬配合物1-Ga。

咔咯1在光照條件下可以有效將DNA鏈切斷，且單線態(tài)氧是咔咯1的主要活性氧物種，而1-Ga光照條件下斷裂DNA涉及的是單線態(tài)氧和羥基自由基，因此有望將其作為光敏劑應用于光動力療法以治療惡性腫瘤[7]。本研究結果進一步證實1-Ga相比咔咯1對腫瘤細胞的細胞毒性更強。已有研究證實在光照條件下，當1-Ga濃度增加至120μmol/L時，1-Ga可以導致80%以上的腫瘤細胞DNA斷裂，而咔咯1濃度增至160μmol/L時只能導致50%DNA發(fā)生斷裂[8]。證實咔咯1-Ga相比咔咯1具有更好的光核酸酶活性，與本文研究結果一致。研究報道咔咯與DNA的相互結合有插入模式、外部結合模式以及自堆積結合模式，而研究咔咯配合物與DNA結合方式與咔咯類似，也可分為嵌插結合、外部結合以及偽插入結合三種類型[9-10]。而配合物與DNA的所有非共價結合都是基于兩者之間的一種弱相互作用力如氫鍵范德華力、離子鍵等[11]。因此推測本研究中咔咯1及1-Ga對A549的細胞作用也可能是通過上述方式與DNA結合并導致DNA鏈發(fā)生斷裂產生，但具體機制仍有待進一步研究揭示。

線粒體作為細胞發(fā)生凋亡過程的關鍵細胞器，細胞受損位點及死亡受體傳遞的信號均會匯集于線粒體上，最終引發(fā)線粒體膜的通透性發(fā)生改變以及膜電位的降低甚至消失。而線粒體內膜電位是電子能量由質子泵傳遞至細胞質側的一種反映，當線粒體膜電位發(fā)生顯著降低常代表細胞發(fā)生凋亡[12]。而JC-1、羅丹明123等親脂性陽離子熒光染料均具有一定的線粒體聚集傾向，因此可以通過觀察熒光染料的熒光顏色或者強度變化判斷細胞內線粒體膜電勢變化趨勢[13]。本研究發(fā)現(xiàn)正常細胞線粒體呈紅色熒光，主要是由于正常細胞線粒體內膜電位較高，JC-1染料在線粒體基質內形成聚合物且發(fā)出紅色熒光；而非正常線粒體中膜電位發(fā)生降低或喪失后，染料呈現(xiàn)出一種單體狀態(tài)并發(fā)生綠色熒光，因此可以通過熒光顏色變化判斷線粒體膜電位變化情況，進而判斷細胞的凋亡進程。本研究結果進一步證實咔咯1和1-Ga對A549的細胞毒性，會破壞細胞的線粒體功能。發(fā)現(xiàn)未經任何處理的對照組A549細胞大部分位于G0/G1期，經咔咯1、1-Ga作用后，咔咯1組A549細胞S期比例變化不大，1-Ga組A549細胞S期比例明顯降低（P＜0.05）；且1-Ga組細胞凋亡比例顯著高于咔咯1組（P＜0.05），說明咔咯1和1-Ga可以誘導S期細胞周期發(fā)生阻滯。已有研究證實咔咯1和1-Ga在光照條件下均可產生單線態(tài)氧，且1-Ga的光核酸酶活性更強的根本原因可能是其具有更快的單線態(tài)氧產生速率[13]。因此推測其細胞周期阻滯機制可能是咔咯化合物通過活性氧(ROS)介導線粒體途徑誘導A549發(fā)生凋亡。本研究通過構建斑馬魚模型證實經咔咯1、1-Ga干預處理后A549細胞發(fā)生細胞生長和轉移的程度明顯降低，且1-Ga組A549細胞轉移程度相比咔咯1組更低，進一步證實兩者對A549細胞的轉移具有抑制作用及其抗腫瘤功效。

綜上所述，咔咯1及1-Ga均具有強烈核酸酶活性，均可抑制A549增殖、轉移，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，且1-Ga細胞毒性更強，有望成為一種新型抗腫瘤藥物應用于惡性腫瘤的治療。