雷帕霉素對Yap1-β-連環(huán)蛋白誘導(dǎo)兒童肝母細(xì)胞瘤抑制作用的研究①

任 慧，趙天嬌，張 娟，陳秀珍，劉 鋒，牛會忠

（河北省兒童醫(yī)院普外科，河北石家莊050000）

肝母細(xì)胞瘤（hepatoblastoma，HB）發(fā)病率約為2.46/100萬，是最常見的兒童肝部惡性腫瘤，多見于2歲以下嬰幼兒。HB的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢[1]。HB的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，Beckwith-Wiedemann綜合征、家族性腺瘤性息肉、低出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒等均增加HB的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后輔助化療是HB的主要治療模式，是患者長期無瘤生存的有效方式。隨著治療水平的提高，HB的預(yù)后明顯改善，低危HB患兒的5年生存率約為80%～90%，但仍有部分因?yàn)榛熌退帯⑿g(shù)后殘留等因素出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，影響治療效果。對HB分子機(jī)制的研究有助于更好的了解HB的發(fā)病機(jī)制，探討新的治療方法[3]。雖然HB發(fā)病率較低并呈散發(fā)性，仍有幾項(xiàng)小樣本的隊(duì)列研究顯示β-連環(huán)蛋白（β-catenin）途徑是導(dǎo)致HB的重要始動因素[4]。已有研究顯示，在60%～70%的HB病理組編碼β-catenin的CTNNB1基因存在缺失或錯(cuò)義突變，破壞β-catenin的磷酸化和降解，導(dǎo)致活性β-catenin持續(xù)累積于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，持續(xù)活化下液靶基因，參與肝母細(xì)胞的發(fā)生[5]。Patel等[6]研究顯示，多數(shù)HB病例中轉(zhuǎn)錄共刺激因子-Yes相關(guān)蛋白（yes-associated protein,YAP）被激活，約80%的HB患者可檢測到Y(jié)AP和β-Catenin的協(xié)同活化。在小鼠中運(yùn)用高壓尾靜脈注射技術(shù)共轉(zhuǎn)染功能活化形式的YAP1和β-catenin可促使HB形成，但其具體機(jī)制仍不清楚。本研究注射YAP1-β-catenin誘導(dǎo)HB，采用哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）抑制劑雷帕霉素（rapamycin,RAPA）進(jìn)行干預(yù)，探討抑制mTOR對Yap1-β-連環(huán)蛋白誘導(dǎo)的兒童肝母細(xì)胞瘤生長發(fā)育的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級FVB/N小鼠18只，8～10周齡，體重20～25g，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。動物許可證號[SCXK（魯）2018-103]，山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心使用許可證號[SYXK（魯）2018-131]。實(shí)驗(yàn)動物采用12h光照-黑暗循環(huán)，自由飲水和進(jìn)食。pt3-ef1αyaps127a和pT3-EF1α-ΔN90-β-catenin由大連寶公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 造模和干預(yù) 常溫融解pt3-ef1α-yaps127a和pT3-EF1α-ΔN90-β-catenin，將10μgpt3-ef1α-yaps127a、10μgpT3-EF1α-ΔN90-β-catenin和4μg PCMV/SB混合于2 mL生理鹽水中。每只小鼠通過高壓尾靜脈注射轉(zhuǎn)染法注射2 mL，小鼠取雙側(cè)尾靜脈進(jìn)行注射，注射過程5～9 s，推注成功可見小鼠短暫性呼吸急促、活動力減弱等心衰癥表現(xiàn)[7]。注射完畢后隨機(jī)將小鼠分為對照組和觀察組各9只，對照組小鼠在注射后保持10周正常飲食，觀察組在注射后保持5周正常飲食，然后采用含19 mg/kg RAPA的飲食治療5周。

1.2.2 超聲檢查 于注射后第4周、7周、8周、9周、10周對小鼠行超聲檢查。采用Vevo?3100小動物超聲成像平臺進(jìn)行評估小鼠的肝臟體積和肝臟腫瘤，探頭頻率20 MHz。小鼠吸入異氟醚和氧氣混合物進(jìn)行鎮(zhèn)靜，首先采用超聲二維成像觀察肝臟和腫瘤，然后切換到三維模式，3D掃描參數(shù)：傳感器頻率21 MHz，輸出功率100%，增益23～27 db，動態(tài)范圍60 db，深度18 mm，3D范圍27～35 mm，三維步長0.1 mm，三維掃描圖像儲存于硬盤中，采用Vevo lab 3.0.0軟件進(jìn)行后期處理。采用多切面法，繪制各切面的肝臟邊界，重建肝臟三維圖像，通過軟件分析計(jì)算肝臟體積，然后逐幀在連續(xù)切面上識別肝臟腫瘤，測量每個(gè)病變體積。根據(jù)第10周腫瘤體積計(jì)算抑瘤率（tumor inhibition rate，TIR）=（對照組腫瘤體積-觀察組腫瘤體積）/對照組腫瘤體積×100%。

1.2.3 HE染色和免疫組化染色 治療后第10周處死小鼠取肝臟，采用10%福爾馬林固定48h，然后石蠟包埋，連續(xù)切石蠟片4μm，晾干玻片后行常規(guī)HE染色和相關(guān)免疫組化染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，生存時(shí)間比較采用Log-Rank法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAPA對HB小鼠模型肝臟體積的影響 注射第4周時(shí)2組小鼠的肝臟體積[（783.7±48.2）mm3vs（805.3±59.6）mm3]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在注射10周末觀察組小鼠肝臟體積[（5 963.7±1 423.5）mm3vs（1 492.3±483.5）mm3]顯著降低（P＜0.05），從7周開始觀察組小鼠肝臟體積增加速度明顯減慢，隨著時(shí)間延長，與對照組肝臟體積差異越來越明顯（圖1～2）。

圖1 RAPA對HB小鼠模型肝臟體積的影響

圖2 RAPA對HB小鼠模型肝臟體積影響的超聲三維重建圖像

2.2 RAPA對HB小鼠模型腫瘤數(shù)量的影響 注射第4周時(shí)2組小鼠的腫瘤數(shù)量[（0.3±0.9）個(gè)vs（0.5±0.8）個(gè)]差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在注射10周末觀察組小鼠腫瘤數(shù)量[（19.4±11.2）個(gè)vs（40.3±8.5）個(gè)]顯著降低（P＜0.05）；與對照組相比較，從第7周開始，觀察組小鼠腫瘤數(shù)量顯著減少，且隨著時(shí)間越長，與對照組小鼠腫瘤數(shù)量差異越來越明顯（圖3）。

圖3 RAPA對HB小鼠模型腫瘤數(shù)量的影響

2.3 RAPA對HB模型小鼠腫瘤直徑的影響 注射第4周時(shí)2組小鼠的腫瘤直徑[（0.5±2.6）mm vs（0.9±3.1）mm]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在注射10周末觀察組小鼠腫瘤直徑[（45.8±23.2）mm vs（179.3±34.6）mm]顯著降低（P＜0.05）；與對照組相比較，從第7周開始，觀察組小鼠腫瘤直徑明顯減少，隨著時(shí)間延長，與對照組小鼠腫瘤直徑差異越來越明顯（圖4）。

圖4 RAPA對HB模型小鼠腫瘤直徑的影響

2.4 RAPA對HB模型小鼠大體形態(tài)的影響對照組小鼠在注射后第10周末因?yàn)槟[瘤形成導(dǎo)致肝臟顯著增大，腫瘤體積顯著高于對照組（圖5）。

圖5 RAPA對HB模型小鼠大體形態(tài)的影響

2.5 RAPA對HB模型小鼠肝臟HE及免疫組化染色的影響HE染色顯示，注射后第10周末，對照組腫瘤的組織學(xué)表現(xiàn)為密集的低分化或未分化HB；RAPA治療組小鼠腫瘤負(fù)荷降低，腫瘤組織由分化良好的細(xì)胞組成，組織學(xué)表現(xiàn)類似于高良好的HB（圖6）。標(biāo)記外源性Δn90-β-連環(huán)蛋白的Myc標(biāo)簽蛋白免疫組化染色顯示，對照組可見大量大小不等的myc標(biāo)簽蛋白陽性HB腫瘤結(jié)節(jié)，占據(jù)肝葉大部；觀察組myc標(biāo)簽蛋白陽性HB結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，肝實(shí)質(zhì)所占比例較大（圖7）。

圖6 RAPA對HB模型小鼠肝臟HE染色結(jié)果的影響（Tu代表腫瘤組織，×100）

圖7 RAPA對HB模型小鼠肝臟免疫組化靶向myc標(biāo)簽染色結(jié)果的影響（×10）

3 討論

HB是兒童時(shí)期常見的肝臟惡性腫瘤，占肝臟原發(fā)性惡性腫瘤的50%～60%，居兒童實(shí)體腫瘤的第3位。HB單純手術(shù)切除效果欠佳，5年生存率僅為20%～30%。近年來隨著輔助化療的應(yīng)用和手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步，HB的5年生存率已經(jīng)顯著提高，但HB化療耐藥和復(fù)發(fā)后的治療仍是HB的治療難點(diǎn)問題[8]。與多數(shù)兒童腫瘤一樣，HB的病因、發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，目前報(bào)道約70%的HB與CTNNB1突變相關(guān)。CTNNB1基因編碼β-catenin，CTNNB1突變導(dǎo)致β-catenin表達(dá)異常，通過MYC腫瘤蛋白活化引起細(xì)胞增殖，Wnt/β-catenin是目前廣泛接受的HB致瘤信號通路，但直接抑制Wnt/β-catenin較難實(shí)現(xiàn)[9]。

本研究結(jié)果顯示，RAPA可顯著減緩HB模型小鼠肝臟腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑和肝臟體積，本研究結(jié)果證明mTOR在HB的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Hippo/YAP信號通路在體內(nèi)控制細(xì)胞增殖和凋亡，已有研究顯示，Yap表達(dá)水平在HB中呈高表達(dá)，高于在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)，且YAP與β-catenin共活化僅見于HB中，較少見原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌[10]。YAP通路可激活mTOR信號通路，調(diào)控細(xì)胞生長，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。mTOR包括mTORC1和mTORC2。mTORC1控制體內(nèi)多種生物學(xué)進(jìn)程，其異常激活與腫瘤、心血管疾病、2型糖尿病、神經(jīng)退行性病變等多種疾病相關(guān)，如在肝細(xì)胞癌中即發(fā)現(xiàn)mTORC1通路激活[11]。在HB細(xì)胞系中存在mTORC1的異常激活，通過YAP1-β-catenin可建立HB動物模型，mTORC1抑制劑MLN0128體外可抑制人HB細(xì)胞的生長[12]。在Yap1-β-catenin動物模型中，YAP1可上調(diào)谷酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體slc38a1表達(dá)，調(diào)節(jié)GS的表達(dá)，調(diào)節(jié)谷氨酰氨表達(dá)水平，促進(jìn)mTORC1的激活[13]。YAP1也可下調(diào)mTOR的負(fù)調(diào)節(jié)因子PTEN來激活mTOR信號[14]。因此多種調(diào)節(jié)mTOR的機(jī)制共同激活可能是HB發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。

目前多種mTOR抑制劑已經(jīng)被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用，體外研究顯示對前列腺癌[15]、結(jié)腸癌[16]、肝癌[17]、乳腺癌[18]等多種實(shí)體腫瘤治療有效，但因?yàn)閙TOR信號通路的復(fù)雜性和存在繼發(fā)耐藥性，mTOR抑制劑臨床應(yīng)用治療腫瘤臨床效果仍存在局限性。RAPA及其類似物具有細(xì)胞抑制作用，可抑制細(xì)胞增殖，與細(xì)胞毒性化療藥物聯(lián)合應(yīng)用顯示具有協(xié)同作用。本研究結(jié)果顯示，在注射第4周時(shí)2組小鼠的肝臟體積[(783.7±48.2)mm3vs(805.37±59.6)mm3]和腫瘤大小[(0.5±2.6)mm vs(0.9±3.1)mm]均無顯著差異，在注射10周末RAPA飲食組小鼠肝臟體積[(5963.7±1423.5)mm3vs(1492.3±483.5)mm3]和腫瘤直徑[(179.3±34.6)mm vs(45.8±23.2)mm]均顯著降低，TIR為72.69%。本研究結(jié)果提示：RAPA飲食可減緩HB腫瘤生長和細(xì)胞增殖；但經(jīng)RAPA飲食干預(yù)的小鼠HB腫瘤并未完全消失，而是腫瘤負(fù)擔(dān)降低。結(jié)果提示，RAPA可抑制HB細(xì)胞增殖，但不能完全殺死腫瘤，可能與HB發(fā)病涉及到多個(gè)信號通路有關(guān)，因此在RAPA治療的同時(shí)應(yīng)聯(lián)合細(xì)胞毒藥物化療以進(jìn)一步提高療效。組織學(xué)觀察顯示，RAPA飲食干預(yù)的小鼠腫瘤組織表現(xiàn)分化程度較好，考慮與以下因素有關(guān)：①RAPA通過抑制mTORC1改變細(xì)胞代謝減緩腫瘤增殖，促進(jìn)HB細(xì)胞分化向增殖緩慢的分化良好的HB細(xì)胞；②YAP1-βcatenin模型存在異質(zhì)性，隨著RAPA干預(yù)時(shí)間延長，RAPA抑制低分化HB細(xì)胞增殖，分化良好HB細(xì)胞在治療過程中持續(xù)存在。

綜上所述，本研究采用mTOR抑制劑RAPA對YAP1-β-catenin模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示RAPA可抑制HB增殖，促使HB向分化良好的組織學(xué)形態(tài)發(fā)展。