MMP-9和COX-2在實(shí)驗(yàn)性牙周炎不同干預(yù)下的差異表達(dá)①

森巴特·毛吾艾，吳澤鈺,2，吳仲蓬，王 琛，趙 今,2

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）牙體牙髓科，2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊830054）

牙周病主要由細(xì)菌和宿主防御系統(tǒng)之間的穩(wěn)定狀態(tài)失調(diào)引起，會導(dǎo)致易感宿主的牙周破壞，從而引起炎癥因子的過表達(dá)[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是一種92 kDa型IV型膠原酶，其參與細(xì)胞外基質(zhì)降解，組織重塑，細(xì)胞受體剝離，以及各種信號分子的加工[2]。環(huán)氧化酶是67-72 kDa的膜蛋白，是在催化膜磷脂花生四烯酸為前列腺素類物質(zhì)過程里的重要限速酶[3]。環(huán)氧化酶有三型，1991年在細(xì)胞分裂的研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2），其作為一種誘導(dǎo)酶，在牙周炎組織的各種細(xì)胞類型中表達(dá)，在牙周炎中起著重要作用[4]。本文旨在研究COX-2與MMP-9在實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織及全身中的表達(dá)情況及意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與主要儀器 蘇木素-伊紅染色液（中杉金橋）；TRAP染色試劑盒（北京索萊寶）；Anti-MMP-9抗體和Anti-COX-2抗體（博奧森）；MMP-9 ELISA Kit和COX-2 ELISA Kit（CUSABIO）；PV6001試劑盒及DAB顯色液（中杉金橋）；全波長酶標(biāo)儀（賽默飛世爾公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取雄性SD大鼠，30只，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，溫度25℃，濕度60%～70%，體重（250±50）g，統(tǒng)一飼料，自由飲食，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。對SD大鼠隨機(jī)分組：正常組、牙周炎組、牙周炎+去結(jié)扎線組（去結(jié)扎線組）、牙周炎+單純刮治組（刮治組）以及牙周炎+刮治組聯(lián)合米諾環(huán)素組（聯(lián)合組），每組6只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)性牙周炎動物模型的建立及干預(yù)措施本實(shí)驗(yàn)選用單純結(jié)扎法造模[5]，將無菌尼龍線（4-0）在大鼠的左上頜第一磨牙的牙頸部結(jié)扎，造模第15天后正常組及牙周炎組處死，其他組開始進(jìn)行干預(yù)：去結(jié)扎線組僅去除結(jié)扎線；刮治組去除線后刮治，每周1次，持續(xù)2周，其余時候用牙間隙刷清潔牙面，每日1次，持續(xù)2周，并用0.9%生理鹽水及3%雙氧水交替沖洗；聯(lián)合組給予刮治組的干預(yù)措施并于齦溝內(nèi)給予20μL 2%的鹽酸米諾環(huán)素，每日1次，持續(xù)2周。記錄相關(guān)指標(biāo)：牙齦的臨床表現(xiàn)、探診深度(probing depth,PD)及牙齦指數(shù)(gingival index,GI)。所有組均正常飲水飲食，干預(yù)組2周后處死并存好所需標(biāo)本。1.3.2形態(tài)學(xué)觀察 將牙體及牙周組織常規(guī)包埋、切片并進(jìn)行HE染色、TRAP染色及免疫組化染色。在光學(xué)顯微鏡（德國Leica DM300)下拍照。免疫組化染色結(jié)果采用Image Pro Plus軟件分析，用平均光密度值來表示。

1.3.3 ELISA檢測血清中COX-2及MMP-9的表達(dá)各組大鼠麻醉后在腹主動脈上取外周血至肝素鈉抗凝管中并靜放2 h，離心15 min后取上清液-80℃冰箱留存，酶標(biāo)儀450 nm下測定其光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，結(jié)果采用（-x±s）表示。對同種測量值為連續(xù)數(shù)值型變量且服從正態(tài)分布的組間比較采用單因素方差分析；對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，則采用K個獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線結(jié)果 拍攝X線片，牙周炎組顯示牙槽骨高度有所降低，與未結(jié)扎的鄰牙牙槽骨形成鮮明對比，符合牙周炎表現(xiàn)從而表明造模成功（圖1）。

2.2 牙周探診深度與牙齦指數(shù) 刮治組及聯(lián)合組的PD以及GI都明顯低于牙周炎組，去結(jié)扎線組較牙周炎組有略微緩解，但差異不大（圖2）。

圖1 X線片表現(xiàn)

圖2各組牙周探診深度與牙齦指數(shù)對比

2.3 HE染色結(jié)果 正常組：牙齦上皮完整，上皮釘突多而長，未見炎癥細(xì)胞浸潤；牙周炎組：齦溝內(nèi)可見結(jié)扎痕跡，上皮釘突消失，可見網(wǎng)眼狀增生的上皮突向結(jié)締組織，其周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；去結(jié)扎線組：與牙周炎組差別不大；刮治組：牙齦上皮的連續(xù)性有一定程度的破壞，但固有層的炎細(xì)胞較牙周炎組相對減少；聯(lián)合組：固有層的炎細(xì)胞明顯減少，固有層有新生血管生成（圖3）。

2.4 TRAP染色結(jié)果 正常組：幾乎沒有破骨細(xì)胞；牙周炎組：骨吸收陷窩可見較多破骨細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)各異，內(nèi)有多個核存在于胞質(zhì)中；去結(jié)扎線組、刮治組及聯(lián)合組的破骨細(xì)胞數(shù)較牙周炎組有明顯的減少（圖4）。

圖3各組HE染色結(jié)果（×100）

2.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果COX-2、MMP-9陽性染色是棕色，主要表達(dá)在牙齦的上皮層，牙周膜上成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)，牙槽骨上的骨細(xì)胞胞質(zhì)及松質(zhì)骨骨髓腔內(nèi)的成骨細(xì)胞胞質(zhì)。正常組：陽性染色細(xì)胞數(shù)目少；牙周炎組：陽性染色細(xì)胞數(shù)目顯著增多；去結(jié)扎線組、刮治組以及聯(lián)合組陽性染色細(xì)胞數(shù)目較牙周炎組有不同程度的減少。采用Image Pro Plus軟件分析并用平均光密度值來表示結(jié)果，結(jié)果顯示牙周炎組與正常組、刮治組、聯(lián)合組進(jìn)行兩兩相比，COX-2和MMP-9的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但去結(jié)扎線組與牙周炎組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見圖5、表1。

圖4各組TRAP染色結(jié)果（×200）

表1牙周膜中COX-2與MMP-9平均光密度值

圖5牙周膜中COX-2與MMP-9表達(dá)情況（×400）

2.6 ELISA檢測分析結(jié)果 牙周炎組血清中炎癥因子COX-2與MMP-9的含量比正常組顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而去結(jié)扎線組與牙周炎組之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；刮治組、聯(lián)合組的COX-2與MMP-9的表達(dá)水平顯著低于牙周炎組，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見圖6。

圖6大鼠血清中MMP-9和COX-2的含量

3 討論

牙周炎是人們熟知的慢性破壞性炎癥性疾病，被認(rèn)為是由于牙周組織的破壞和修復(fù)之間的不平衡引起的，由牙周袋中存在的細(xì)菌引發(fā)，并可能因全身疾病而加重[6]。事實(shí)上，大部分組織破壞是由宿主對口腔細(xì)菌的反應(yīng)引起的，因此提出宿主反應(yīng)調(diào)節(jié)治療[7-8]。宿主反應(yīng)調(diào)節(jié)治療包括：使用非甾體抗炎藥來減少COX-2從而降低其催化的代謝產(chǎn)物前列腺素的產(chǎn)生，達(dá)到減少炎癥反應(yīng)的目的[9]；使用多西環(huán)素或四環(huán)素類來減少宿主來源的基質(zhì)金屬蛋白酶，從而保存包括骨在內(nèi)的牙周組織而不產(chǎn)生抗生素抗藥性[10]；使用雙膦酸鹽來減少募集、依附和活化破骨細(xì)胞的特性，以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶，從而減少骨吸收[11]，由此可見COX-2、MMP-9在牙周炎的進(jìn)展及炎癥的消退階段中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)采用絲線結(jié)扎法建立慢性牙周炎動物模型，2周后均出現(xiàn)明顯的牙周炎表現(xiàn)，進(jìn)行2周的干預(yù)后的治療組組織形態(tài)學(xué)觀察的炎癥狀態(tài)有所降低。這與Moro等[12]的造模后的炎癥狀態(tài)相似，其使用單純結(jié)扎導(dǎo)致大鼠牙周炎后使用COX-2抑制劑后發(fā)現(xiàn)在第7、14、21天COX-2基因表達(dá)顯著增加，但本研究只干預(yù)了2周后觀察COX-2的表達(dá)變化，啟示我們在疾病的進(jìn)展階段做到分批處死大鼠后觀察炎癥因子的變化，可能會更有說服力。Karatas等[13]亦使用單純結(jié)扎導(dǎo)致大鼠牙周炎后使用天然藥物肉桂酸進(jìn)行干預(yù)，免疫組化染色結(jié)果可測得牙周炎組COX-2水平較高，肉桂酸降低了COX-2的表達(dá)水平，這與本研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)免疫組化檢測結(jié)果顯示COX-2牙周炎組較其他組相比陽性染色細(xì)胞數(shù)目多，而刮治組與聯(lián)合組COX-2陽性染色細(xì)胞數(shù)目有所減少（P＜0.05），提示在牙周治療過程中隨炎癥程度的緩解，COX-2表達(dá)水平有所降低。

已有研究報道證明增加MMP-9蛋白表達(dá)導(dǎo)致促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和加速破骨細(xì)胞吸收[14]。Wu等[15]使用單純結(jié)扎導(dǎo)致大鼠牙周炎后使用天然藥物紅茶中的多酚茶黃素進(jìn)行干預(yù)，使用免疫組織化學(xué)染色評估MMP-9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)后會明顯下調(diào)MMP-9的表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Emingil[16]在一項(xiàng)隨機(jī)實(shí)驗(yàn)中收集牙周炎患者齦溝液，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素治療組患者的MMP-9表達(dá)水平降低，本研究中ELISA結(jié)果亦觀察到牙周炎組血清中的MMP-9炎癥因子水平升高，而干預(yù)組MMP-9炎癥因子水平降低，提示在牙周治療后隨炎癥程度的緩解，MMP-9會隨之降低。

上述證據(jù)表明實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織中COX-2、MMP-9的表達(dá)水平會隨著刮治等干預(yù)處理后有所降低，表明其可能是潛在的牙周炎的診斷指標(biāo)，為后續(xù)靶向治療提供新的思路。