過氧化氫體外誘導(dǎo)細(xì)粒棘球絳蟲囊泡氧化損傷模型的建立①

文麗梅，鞏月紅，呂國棟，張嘉偉，王建華

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)科，烏魯木齊830054；2新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，烏魯木齊830011；4新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊830054）

包蟲病又稱棘球蚴?。╡chinococcosis）是由棘球絳蟲的蚴蟲寄生于人體所致的一種嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲疾病，95%病例為細(xì)粒棘球蚴（Echinococcus granulosus，Eg）感染所致囊型包蟲?。╟ystis echinococcosis，CE）。該病呈全球分布，我國西部地區(qū)為高流行區(qū)，但隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，人口流動的增加，寵物(犬)和經(jīng)濟動物(狐貍)養(yǎng)殖數(shù)量增多，包蟲病已從我國的西北部向東南部、由畜牧地區(qū)向農(nóng)業(yè)地區(qū)等逐漸蔓延，嚴(yán)重影響人類健康，已成為倍受關(guān)注的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[1-2]。

青蒿素類藥物的抗寄生蟲作用機制分為[3]：Fe2+依賴的活性氧鍵斷裂后產(chǎn)生的自由基使寄生蟲體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的升高，導(dǎo)致其死亡；過氧橋鍵被迅速氧化從而減少蟲體內(nèi)抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）/硫氧還蛋白系統(tǒng)的輔助因子，導(dǎo)致GSH不能控制蟲體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和ROS的升高。氧化損傷作為抗包蟲藥物的重要機制之一，目前尚無關(guān)于細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴氧化損傷模型的研究。

生理情況下機體存在自動修復(fù)的氧化及抗氧化均衡系統(tǒng)。在病理情況下，自由基產(chǎn)生過多抑或體內(nèi)抗自由基能力不足時，氧化應(yīng)激發(fā)生，機體的氧化還原失衡，隨之出現(xiàn)級聯(lián)式生化反應(yīng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生氧化損傷[4]。自由基清除劑（FRS）是指具有延遲、抑制和阻斷ROS/氧自由基（OFR）氧化損傷的物質(zhì)的總稱，是能夠與OFR結(jié)合并使之清除的機體保護劑[5]。N-乙酰半胱氨酸（NAC），作為一種新型氧自由基清除劑，可直接發(fā)揮抗氧化作用，同時又是谷胱甘肽的前體，它能夠提高細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽及過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等的含量，維持細(xì)胞氧化還原平衡以及保護細(xì)胞不受氧化損傷、阻止氧化張力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、從而具有清除自由基和保護細(xì)胞作用[6-8]。

本研究通過檢測H2O2和NAC干預(yù)細(xì)粒棘球絳蟲囊泡后活性氧含量檢測，塌陷率統(tǒng)計和超微結(jié)構(gòu)觀察，建立H2O2誘導(dǎo)體外細(xì)粒棘球絳蟲囊泡氧化損傷模型，為抗包蟲病藥物氧化損傷作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，美國Thermo公司生產(chǎn)；濕熱滅菌鍋，購自日本SANYO公司；SW-CJ-IFD型超凈操作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；DM1400 B型倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司生產(chǎn)；-80℃冰箱，購自美國Thermo公司；-20℃冰箱(SC-329GA)，購自中國海爾公司；激光共聚焦顯微鏡（SP8），購自德國Leica公司。

1.2 試劑 胎牛血清，購于美國Hyclone公司；青、鏈霉素和RPMI1640培養(yǎng)基購自于美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO），購自美國Amresco公司；過氧化氫（H2O2），購自于天津永晟精細(xì)化工有限公司；N-乙酰半胱氨酸和活性氧檢測試劑盒，均購自于碧云天生物有限公司。

1.3 原頭蚴及囊泡培養(yǎng) 羊源細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)無菌取自新疆烏魯木齊華凌屠宰市場病羊肝包囊，無菌抽取囊液，經(jīng)清洗、胃蛋白酶處理[9]和活力檢測后置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。囊泡為細(xì)粒棘球絳蟲體外培養(yǎng)發(fā)育而成，直徑2～3 mm。

1.4 方法

1.4.1 H2O2和NAC處理囊泡后活性氧含量檢測 取符合實驗標(biāo)準(zhǔn)的囊泡按每孔10個接種于96孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。采用終濃度為0、50、100、200μmol/L和400μmol/L的H2O2聯(lián)合終濃度為0、1、2 mmol/L和5 mmol/L的NAC預(yù)先干預(yù)2 h囊泡，處理0.5 h后進行活性氧的檢測，檢測方法按照說明書進行操作。

1.4.2 H2O2和NAC處理囊泡后活性氧觀察 取培養(yǎng)的囊泡按每孔10個接種于96孔板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。分組設(shè)置為1%DMSO組、50μmol/L H2O2組、100μmol/L H2O2組、200μmol/L H2O2組、200 μmol/L H2O2+5 mmol/L NAC組和5 mmol/L NAC組，共6組，其中200μmol/L H2O2+5 mmol/L NAC組和5 mmol/L NAC組，先采用終濃度為5 mmol/L的NAC對細(xì)粒棘球絳蟲囊泡預(yù)先干預(yù)2 h，然后進行DMSO和H2O2的干預(yù)0.5 h（5 mmol/L NAC組不再做任何處理），收集囊泡。采用DCF-DA（10μmol/L）和Hoechst 33342（10μg/mL）在37℃下避光孵育30 min。孵育后，PBS清洗3遍，采用激光共聚焦顯微鏡對其體內(nèi)活性氧進行定性觀察，并拍照。

1.4.3 H2O2和NAC干預(yù)囊泡后其活性的檢測 取培養(yǎng)的囊泡按每孔25個接種于96孔孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。分組為DMSO組、H2O2（200μmol/L）組和H2O2（200μmol/L）+5 mmol/LNAC組，干預(yù)4 d，每1 d對囊泡的塌陷情況觀察并記錄，統(tǒng)計分析塌陷率，活性（%）=（100-塌陷率）%。

1.4.4 H2O2和NAC處理囊泡后超微結(jié)構(gòu)觀察 取培養(yǎng)的囊泡按每孔25個接種于96孔板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。分組為DMSO組、H2O2(100μmol/L)、H2O2(200μmol/L)和H2O2（200μmol/L）+5 mmol/L NAC（預(yù)前2 h），干預(yù)0.5 h后，收集囊泡。PBS清洗3遍，將其保存在4%戊二醛混合液中24 h，再依次用雙重固定法固定和1%鋨酸固定1 h，經(jīng)脫水、包埋、切片、染色后用透射電鏡觀察囊泡超微結(jié)構(gòu)變化并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和囊泡形態(tài)學(xué)觀察 羊源無菌提取的細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴形態(tài)清晰，其中存在大量鈣顆粒，見圖1A；經(jīng)體外培養(yǎng)后的囊泡形態(tài)飽滿，界限明顯，見圖1B；經(jīng)藥物干預(yù)發(fā)生損傷的囊泡，見圖1C，形態(tài)塌陷，界限模糊；圖1D和圖1E為培養(yǎng)過程中的囊泡。

圖1細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和囊泡形態(tài)學(xué)觀察

2.2 H2O2和NAC對原頭蚴體內(nèi)ROS含量的影響H2O2和NAC處理原頭蚴后其體內(nèi)的ROS含量隨著H2O2濃度從50μmol/L增加到400μmol/L，囊泡中的ROS含量逐漸增加。此外，5 mmol/L的NAC可明顯抑制H2O2引起的囊泡中ROS含量增多作用。實驗結(jié)果表明200μmol/L的H2O2可明顯增加囊泡體內(nèi)的ROS含量，且5 mmol/L的NAC可明顯抑制其活性ROS的升高，見圖2。

圖2 H2O2和NAC對囊泡內(nèi)ROS含量的影響

2.3 采用激光共聚焦顯微鏡對原頭蚴體內(nèi)ROS的觀察 隨著H2O2濃度的升高，原頭蚴體內(nèi)的ROS熒光強度逐漸增強，結(jié)果表明200μmol/L H2O2組的原頭蚴體內(nèi)ROS含量最高，與5 mmol/L NAC聯(lián)用后，ROS熒光強度減弱。由此可見，5 mmol/L NAC對H2O2誘導(dǎo)的原頭蚴體內(nèi)的ROS熒光強度有較好的抑制作用，見圖3。

2.4 H2O2和NAC對囊泡活性的影響 H2O2干預(yù)囊泡2 d后，囊泡活性明顯下降，200μM H2O2組的活性降至0%，200μmol/L H2O2+5 mmol/L NAC組的活性為（75.41±4.76）%，5 mmol/L NAC組和空白組的活性均為100%，說明200μmol/L的H2O2可明顯造成囊泡的塌陷，而5 mmol/L的NAC可明顯抑制H2O2造成的塌陷，見圖4。

2.5 H2O2和NAC對原頭蚴超微結(jié)構(gòu)的影響DMSO組的合胞體帶完整，微絨毛完整，無病變；100μmol/L H2O2組的囊泡合胞體帶疏松、擴張，出現(xiàn)水樣結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)成分釋放較多，出現(xiàn)異染色質(zhì)；200μmol/L H2O2組合胞體帶疏松、擴張，出現(xiàn)水樣結(jié)構(gòu)和嗜鋨體，胞質(zhì)成分釋放較多，異染色質(zhì)較多；NAC干預(yù)組，合胞體帶完整，微絨毛散在，核仁固縮，無異染色質(zhì)。結(jié)果顯示：H2O2可損傷囊泡的超微結(jié)構(gòu)，并造成DNA損傷；NAC可緩解H2O2對囊泡造成的損傷。見圖5。

圖3采用激光共聚焦顯微鏡對H2O2和NAC干預(yù)囊泡后體內(nèi)ROS的觀察

圖4 H2O2和NAC對囊泡活性的影響

圖5采用電鏡對H2O2和NAC干預(yù)后囊泡的超微結(jié)構(gòu)觀察

3 討論

本研究顯示，隨著H2O2含量的升高囊泡體內(nèi)的ROS含量逐漸升高，其中5mmol/L NAC對H2O2誘導(dǎo)的囊泡體內(nèi)的ROS含量升高有較好的抑制作用。采用塌陷率對H2O2及H2O2與5 mmol/L NAC聯(lián)合干預(yù)囊泡的藥效進行評價，發(fā)現(xiàn)與NAC聯(lián)合干預(yù)可以有效改善H2O2單獨干預(yù)囊泡造成的損傷。同時，采用電鏡對藥物干預(yù)后囊泡的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)H2O2可導(dǎo)致囊泡體內(nèi)異染色質(zhì)的增多，說明其可能對囊泡的DNA造成損傷。文獻(xiàn)[10]報道，金屬離子參與DNA氧化損傷，其作用大小主要取決于金屬活化H2O2的能力（Fenton反應(yīng)）和金屬離子與DNA分子的親和力，這與本研究結(jié)果一致。然而，NAC干預(yù)組，合胞體帶完整，微絨毛散在，核仁固縮，無異染色質(zhì)，NAC可明顯改善H2O2對囊泡超微結(jié)構(gòu)造成的損傷。采用激光共聚焦對囊泡內(nèi)的ROS分布量進行觀察，其結(jié)果以ROS含量檢測結(jié)果一致。

H2O2是一種重要的ROS，非常容易穿過細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)的Fe2+通過Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基（·OH），導(dǎo)致一系列反應(yīng)。因H2O2容易獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，操作比較簡單，所以是目前應(yīng)用最為廣泛的氧化損傷模型的應(yīng)激源，是研究各類細(xì)胞氧化損傷時使用的主要方法之一[11]。然而，以H2O2為刺激源誘導(dǎo)建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的方法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，但關(guān)于建立細(xì)粒棘球絳蟲囊泡的氧化應(yīng)激損傷模型的報道極少，且判別標(biāo)準(zhǔn)不完全相同。本研究采用檢測囊泡塌陷率作為判定囊泡活性檢測指標(biāo)，同時，采用活性氧檢測試劑盒直接對H2O2和NAC干預(yù)原頭蚴后體內(nèi)的ROS含量進行檢測。

綜上所示，H2O2可誘導(dǎo)細(xì)粒棘球絳蟲囊泡氧化應(yīng)激模型的建立，且NAC可有效抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，為抗包蟲病藥物氧化損傷作用研究的重要抑制劑之一。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2可能損害囊泡的DNA，需要后續(xù)實驗進一步證實。