泡球蚴感染小鼠肝臟差異表達(dá)miRNA篩選及其作用通路分析①

劉 輝，葉建蔚，張凱楠，呂國(guó)棟

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1臨床醫(yī)學(xué)研究院，2腫瘤中心，烏魯木齊830054)

包蟲(chóng)病是棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)感染并寄生所致的疾病，多房棘球蚴（泡球蚴）感染人體所致的泡型包蟲(chóng)?。ˋlveolar echinococcosis，AE)是我國(guó)西部牧區(qū)高發(fā)的一種人畜共患病[1]。肝臟是泡球蚴寄生的主要器官之一，泡球蚴以出芽生殖的方式浸潤(rùn)病灶旁肝臟，和肝癌的臨床特征較為相似，如未經(jīng)治療，10年病死率高達(dá)90%，故又稱“蟲(chóng)癌”[2]。在泡球蚴感染中間宿主的過(guò)程中，寄生蟲(chóng)和宿主之間的相互作用極其復(fù)雜，其致病機(jī)制有待進(jìn)一步闡明[3]。

微小RNA（miRNA）是一類重要的非編碼RNA，在免疫調(diào)控、機(jī)體發(fā)育、代謝合成等基礎(chǔ)生理功能的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，miRNA通過(guò)抑制靶基因翻譯或靶基因mRNA降解等方式，誘導(dǎo)基因沉默[4]。在腫瘤、代謝性和感染性等疾病的致病過(guò)程中miRNA是關(guān)鍵參與者[5]，如miR-34a等是致癌基因[6]，而let-7是抑癌基因[7]。miRNA作為疾病的診斷標(biāo)志物和干預(yù)靶標(biāo)成為研究的熱點(diǎn)。在包蟲(chóng)病研究中，Orsten等[8]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-4659a-5p和hsa-miR-4518等miRNA在囊型包蟲(chóng)病患者血清中低表達(dá)。Boubaker等[9]發(fā)現(xiàn)MMU-miR-148a-3p和MMU-miR-101b-3p等miRNA在小鼠感染泡球蚴早期的肝臟中的基因表達(dá)受到調(diào)控。泡球蚴感染中期是一個(gè)非常重要的階段[10]，這個(gè)階段發(fā)揮調(diào)控作用的miRNA極具研究?jī)r(jià)值。因此本研究用基因芯片技術(shù)篩選了泡球蚴感染中期差異表達(dá)的miRNA，并預(yù)測(cè)了這些miRNA可能影響的生物學(xué)功能和信號(hào)通路，為進(jìn)一步鑒定在泡型包蟲(chóng)病致病性中起作用的miRNA奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取54只SPF級(jí)雌性健康Balb/c小鼠，8～10周齡，體重18～20 g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為室溫20～25℃，相對(duì)濕度40%，自由飲水飲食。

1.2 材料 Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，哺乳動(dòng)物用miRNAs微陣列芯片及對(duì)應(yīng)試劑盒購(gòu)于北京博奧生物有限公司，固體石蠟購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑廠，甲醛溶液等購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司，蘇木素和伊紅染料購(gòu)于北京中杉金橋試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 泡球蚴獲取 無(wú)菌操作下從泡球蚴保種鼠腹腔中取出泡球蚴的囊泡組織，經(jīng)勻漿后，生理鹽水反復(fù)沖洗，過(guò)濾除去囊泡碎片，收集泡球蚴原頭蚴。采用伊紅染色法檢測(cè)原頭蚴活性并計(jì)數(shù)，制備20 000個(gè)原頭蚴/mL的混懸液用于泡球蚴感染小鼠造模。

1.3.2 動(dòng)物模型建立 54只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，其中包括：泡球蚴感染實(shí)驗(yàn)組24只、生理鹽水對(duì)照組和空白對(duì)照組各15只。使用10%水合氯醛麻醉實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠，使用醫(yī)用碘伏對(duì)小鼠腹部區(qū)域進(jìn)行消毒，使用醫(yī)用酒精進(jìn)行脫碘，區(qū)域覆蓋整個(gè)腹部。在小鼠中上腹，用眼科剪暴露1個(gè)約0.5 cm切口，肉眼直視找到小鼠肝臟，在小鼠左肝最大葉注射原頭蚴懸液0.1 mL/只（實(shí)驗(yàn)組），以建立肝泡球蚴病小鼠動(dòng)物模型。對(duì)照組小鼠注射等量的生理鹽水。

1.3.3 小鼠肝組織病理標(biāo)本取材及HE染色 建模3個(gè)月后，開(kāi)腹取材小鼠左葉肝組織，分為兩部分，一部分用于RNA提取，一部分用于基礎(chǔ)病理檢測(cè)。經(jīng)生理鹽水沖洗及組織修整、甲醛溶液固定、梯度脫水、石蠟包埋和組織蠟塊切片等實(shí)驗(yàn)操作，以制備肝臟病理切片。各實(shí)驗(yàn)組肝臟病理切片經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理結(jié)構(gòu)及拍照。

1.3.4 小鼠肝組織總RNA提取 泡球蚴感染組和生理鹽水對(duì)照組小鼠肝組織，采用Trizol試劑盒提取RNA，操作步驟參考其說(shuō)明書(shū)。制備好的RNA經(jīng)紫外分光度檢測(cè)RNA濃度和純度，甲醛變性凝膠電泳，檢測(cè)RNA的完整性。選取OD260/280約2.0和未降解的RNA樣品用于miRNA芯片檢測(cè)。

1.3.5 miRNAs芯片雜交、掃描肝組織miRNA檢測(cè)采用哺乳動(dòng)物miRNAs微陣列芯片V4.0試劑盒標(biāo)記，操作步驟參考其說(shuō)明書(shū)。泡球蚴感染組和生理鹽水對(duì)照組小鼠肝臟RNA，經(jīng)miRNA分離、miRNAs熒光標(biāo)記等步驟，制備獲得miRNA標(biāo)記產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)入到0.2 mL離心管，95°C，持續(xù)3 min使RNA變性，隨后迅速將產(chǎn)物放置在冰上，持續(xù)2 min，瞬時(shí)離心，即可和哺乳動(dòng)物miRNAs微陣列芯片雜交。雜交后進(jìn)行芯片掃描、圖像采集與數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 生物信息學(xué)分析 在差異miRNA中選取差異倍數(shù)＞2.5的miRNAs（miR-21-5p、miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-494-3p），使用TargetScan（http://www.targetscan.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)上述miRNA的靶基因，使用David7.2數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)目標(biāo)miRNA的靶mRNA進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）分析，使用R3.6.2繪制圖例。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟病理結(jié)果 生理鹽水組和空白對(duì)照組小鼠肝葉病理結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A和1B）。感染組小鼠肝臟病灶旁可見(jiàn)炎性細(xì)胞帶（圖1C）。

圖1 C57小鼠感染泡球蚴3個(gè)月肝臟HE染色結(jié)果（×200）

2.2 miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果 泡球蚴感染組和生理鹽水對(duì)照組小鼠肝臟的經(jīng)熒光標(biāo)記的miRNA，均成功與哺乳動(dòng)物miRNAs微陣列芯片雜交（圖2）。與對(duì)照組相比，共發(fā)現(xiàn)46個(gè)具有差異表達(dá)的miRNA,其中包括29個(gè)上調(diào)miRNAs和17個(gè)下調(diào)miRNAs。進(jìn)一步分析，上調(diào)差異大于2倍有19個(gè)，而下調(diào)大于2倍的有2個(gè)。從上調(diào)miRNAs中選取上調(diào)差異大于2.5倍的6個(gè)miRNA（miR-21-5p、miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-494-3p）用于下一步分析（表1）。

表1肝泡型包蟲(chóng)病差異表達(dá)miRNAs的上調(diào)倍數(shù)及其功能

圖2泡球蚴感染組和生理鹽水組小鼠肝臟miRNA芯片雜交圖

2.3 miRNA芯片生物信息學(xué)分析結(jié)果 為了明確差異miRNA可能的生物學(xué)功能，利用Targetscan數(shù)據(jù)對(duì)6個(gè)差異的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，選取重復(fù)出現(xiàn)2次以上的靶基因（n=243）進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，去除未被數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的靶基因，共計(jì)235個(gè)靶基因用于GO和KEGG分析。GO分析提示靶基因與DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)等重要細(xì)胞生物功能相關(guān)（圖3A）。KEGG分析指出：靶基因與軸突引導(dǎo)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路、胞吞作用、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、磷脂酰肌醇激酶（PI3K-AKT）信號(hào)通路和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥等通路相關(guān)（圖3B）。

圖3差異miRNAs的235個(gè)靶基因的前20個(gè)GO分析（A）和KEGG通路分析（B）條目

3 討論

miRNA在疾病致病過(guò)程中具有重要調(diào)控作用，可作為臨床診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。本研究在泡球蚴感染3個(gè)月小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)miR-21-5p、miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-494-3p等miRNA高表達(dá)，其靶基因主要與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)功能相關(guān)，并參與了軸突引導(dǎo)、TGF-β信號(hào)通路和胞吞作用等信號(hào)通路。本研究為進(jìn)一步鑒定在泡球蚴感染過(guò)程中起重要作用的miRNA奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些可能參與泡球蚴感染的重要基因和信號(hào)通路。

本研究發(fā)現(xiàn)的miR-21-5p[11]、miR-223-3p[11-12]等miRNA已在肝泡型包蟲(chóng)病和囊型包蟲(chóng)病中被報(bào)道高表達(dá)。其中miR-21-5p是在腫瘤[13]和心血管疾病[14]中促進(jìn)細(xì)胞增殖并發(fā)揮重要作用的RNA，是肝癌等腫瘤的診斷標(biāo)記物和干預(yù)靶標(biāo)。Eroglu等[11]在囊型包蟲(chóng)病和泡型包蟲(chóng)病患者肝臟中均發(fā)現(xiàn)miR-21-5p高表達(dá)，然而miR-21-5p在泡型包蟲(chóng)病致病機(jī)制中的作用尚未鑒定。miR-223-3p在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[15]和肝損傷[16]等疾病中發(fā)揮重要作用。Fuller-Carter等[17]發(fā)現(xiàn)miR-223-3p能調(diào)控視神經(jīng)再生。另外，miR-223是睪丸癌的診斷標(biāo)志物[18]。因此本研究推測(cè)miR-21-5p和miR-223-3p在泡型包蟲(chóng)病的致病機(jī)制中可能發(fā)揮了重要作用，可能是泡型包蟲(chóng)病的診斷和治療的靶標(biāo)，具有較大研究?jī)r(jià)值。

miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p和miR-494-3p在多種疾病中發(fā)揮重要作用。Li等[19]發(fā)現(xiàn)由miR-148-3p/FGF2信號(hào)通路組成的信號(hào)級(jí)聯(lián)通路可能是預(yù)防骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的潛在治療靶點(diǎn)。Flammang等[20]發(fā)現(xiàn)在胰腺導(dǎo)管腺癌中miR-192-5p具有抑制腫瘤作用，可作為胰腺導(dǎo)管腺癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物。Lin等[21]發(fā)現(xiàn)miR-494-3p通過(guò)靶向PTEN（人10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因）促進(jìn)PI3K/AKT通路過(guò)度活化，從而促進(jìn)了肝癌病程進(jìn)展。因此，這4個(gè)分子也可作為研究泡型包蟲(chóng)病致病機(jī)制的候選miRNA。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)軸突引導(dǎo)、TGF-β信號(hào)通路和胞吞作用等信號(hào)通路被激活。由于泡球蚴感染導(dǎo)致病灶周邊的肝臟纖維化，Wang等[22]已明確TGF-β信號(hào)通路在泡型包蟲(chóng)病肝臟中被激活。

本研究從miRNA轉(zhuǎn)錄組水平探討了泡球蚴感染中發(fā)揮作用的miRNA及其調(diào)控的基因，并對(duì)這些基因的生物學(xué)功能及作用通路可能的影響進(jìn)行了探討，為闡明泡型包蟲(chóng)病的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。