他克莫司治療囊型棘球蚴病小鼠對(duì)鈣磷酸調(diào)節(jié)酶和免疫因子的影響①

李錦田，木扎拜爾·木合塔爾，顏明智，呂國(guó)棟，馬桂芝

（1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；2喀什地區(qū)婦幼保健院，新疆喀什844000；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊830054）

囊型包蟲(chóng)病（Cystic Echinococcosis，CE）是由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus granulosus）幼蟲(chóng)引起的一種呈世界性分布的人畜共患寄生蟲(chóng)疾病，嚴(yán)重威脅生命健康并給畜牧業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失[1]。該疾病的病理學(xué)特征是主要在肝臟和肺中形成充滿液體的囊腫，目前除手術(shù)外，世界衛(wèi)生組織推薦阿苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑亞砜作為治療包蟲(chóng)病的首選藥物[2]。然而，這些苯并咪唑類藥物殺蟲(chóng)的效果非常緩慢，具有吸收效果差，且需要患者長(zhǎng)時(shí)間高劑量服藥并易產(chǎn)生耐藥性等不足[3]。因此，研發(fā)具有更高驅(qū)蟲(chóng)活性的藥物治療囊型包蟲(chóng)病非常必要。

由于mTOR信號(hào)通路具有獨(dú)特的感知和整合多種不同環(huán)境和激素信號(hào)的能力，在細(xì)胞增殖、存活、自噬、代謝和免疫等多種生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。mTOR信號(hào)通路抑制劑主要包括雷帕霉素與其合成的類似物以及其他相關(guān)的聚酮大環(huán)內(nèi)酯[5]。這些藥物通過(guò)結(jié)合FK506結(jié)合蛋白(FKBPs)發(fā)揮其生物學(xué)作用，形成藥物-蛋白復(fù)合物，隨后與參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的鈣調(diào)磷酸酶和雷帕霉素靶蛋白相互作用并使其失活。據(jù)報(bào)道，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)中克隆出FK506結(jié)合蛋白（FK506-binding proteins，F(xiàn)KBPs）基因，與渦蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、多房棘球絳蟲(chóng)的FKBPs基因序列對(duì)發(fā)現(xiàn)保守結(jié)構(gòu)域比較為保守[6-7]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑TAC在體外具有抑制原頭蚴活性以降低生存率并在體內(nèi)具有治療囊型棘球蚴病小鼠的效果[8-9]。TAC在臨床應(yīng)用中作為免疫抑制劑，通過(guò)影響T細(xì)胞分化為CD4+、CD8+和Th17效應(yīng)細(xì)胞或者調(diào)節(jié)鈣磷酸調(diào)節(jié)酶（Calcineurin，CaN）活性發(fā)揮其免疫抑制作用[10]。然而，TAC在治療囊型棘球蚴病小鼠時(shí)是否通過(guò)影響了CaN含量和機(jī)體免疫因子水平來(lái)發(fā)揮抗蟲(chóng)活性仍未明確。因此，本研究探討TAC治療細(xì)粒棘球蚴感染小鼠后對(duì)其血清中免疫因子和CaN含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材 電子天平（Sartorius，美國(guó)）、離心機(jī)（Thermo scientific，美國(guó)）、流式細(xì)胞儀（FACSAriallBD，美國(guó)）、酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 他克莫司藥物（MedChem Express，美國(guó)）、Ca2+檢測(cè)試劑盒（Cayman，美國(guó)）、鈣調(diào)磷酸蛋白檢測(cè)試劑盒（AssayBiotech，美國(guó)）、BD CBA人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子試劑盒（BD，美國(guó)）。

1.3 通過(guò)腹腔注射細(xì)粒棘球蚴建立囊型棘球蚴病C57小鼠動(dòng)物模型 感染細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的羊肝購(gòu)自于新疆烏魯木齊市華凌屠宰場(chǎng)，在無(wú)菌的環(huán)境下，用注射器將囊液抽出，剪刀將囊壁剪碎，生理鹽水清洗、過(guò)濾、沉淀后分離原頭蚴，使用1%豬胃蛋白酶在37℃水浴鍋中消化30 min后，PBS清洗3遍，使用1%伊紅染液對(duì)獲取的原頭蚴進(jìn)行活力檢測(cè)，當(dāng)其存活率95%以上，該批次原頭蚴可用于小鼠腹腔造模。從維通利華購(gòu)買16 g左右5周齡的雌性C57小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，每只小鼠注射100μL 2 000頭新鮮原頭蚴的生理鹽水混懸液，每只籠子5只小鼠，飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，12 h晝夜更替，濕度為50%，定期清理鼠籠并保持籠內(nèi)清潔。

1.4 鈣調(diào)磷酸酶抑制劑TAC治療囊型棘球蚴病C57小鼠動(dòng)物模型 小鼠造模4個(gè)月后，使用B超檢測(cè)小鼠腹腔內(nèi)是否成功生長(zhǎng)了囊泡，將造模成功的小鼠分為5組，每組8只：溶劑組、5 mg/kg ABZ組、治療組TAC（1 mg/kg[11-12]、2 mg/kg、4 mg/kg），藥物的溶劑為0.5%的羧甲基纖維素鈉與8%的吐溫80的混合物，藥物配制后儲(chǔ)存在4℃冰箱中，每?jī)商炫?次藥，藥物的灌胃容量為0.25 mL/只，連續(xù)灌胃30 d。給藥結(jié)束后，將小鼠麻醉后，進(jìn)行心臟采血，脫頸處死后，取出小鼠體內(nèi)囊泡，使用生理鹽水清洗若干次，使用注射器將囊泡中的囊液吸出，與囊壁分別裝入離心管中，-80℃凍存以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5 小鼠體內(nèi)囊泡中鈣磷酸調(diào)節(jié)酶濃度檢測(cè) 根據(jù)鈣調(diào)磷酸蛋白檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)對(duì)樣品進(jìn)行處理，用pH值為7.4磷酸鹽緩沖溶液沖洗囊泡組織，在0.5～1 mL含有蛋白酶抑制劑的冷1×PBS緩沖液中勻漿2～4 min，10 000 g，4℃離心15 min，取上清液放在冰上，用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至16 ng/mL、8 ng/mL、4 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL用來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在96孔板中進(jìn)行加樣，每個(gè)樣本重復(fù)2個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和待測(cè)樣本孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣本50μL，再加入生物素抗原工作液50μL，37℃培育箱孵育60 min。洗滌孵育結(jié)束后，每個(gè)待測(cè)孔中各加入50μL顯色液A和顯色液B，37℃避光顯色10 min，加入50μL終止液，終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)為450 nm下檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本中鈣磷酸調(diào)節(jié)酶的濃度。

1.6 囊泡組織鈣離子濃度檢測(cè) 根據(jù)Ca2+檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)對(duì)樣品進(jìn)行處理，使用預(yù)冷的PBS溶液沖洗囊泡囊壁3次，去除多余的組織，將囊泡組織勻漿后，10 000 g，4℃離心15 min，收集上清液，儲(chǔ)存在冰上。將等體積的Ca2+檢測(cè)物R1與Ca2+檢測(cè)物R2混合渦旋制備工作液待用，在96孔板中進(jìn)行加樣，標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔各10μL，每個(gè)樣本重復(fù)2個(gè)復(fù)孔，每孔加入200μL探測(cè)物試劑，輕輕渦旋混勻，室溫孵育5 min，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570～590 nm處讀取吸光度，計(jì)算待測(cè)樣本中Ca2+濃度。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠血清中免疫因子含量TAC治療囊型棘球蚴病小鼠30 d后，小鼠眼眶采血，將小鼠血液樣本放室溫2 h后，3 500 r/min，4℃離心15 min，取上清液，棄去溶血樣本。根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)將白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF)、干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）捕獲微球混合備用，將Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品在流式管用實(shí)驗(yàn)稀釋液按梯度稀釋，吹打混勻。待測(cè)樣本、混合微球與Th1/Th2/Th17 PE檢測(cè)試劑各50μL加入流式管中，渦旋混勻，上機(jī)檢測(cè)后記錄數(shù)據(jù)，使用BD?Cytometric Bead Array(CBA)FCAPArray Software v3.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，藥物治療組與溶劑組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 囊型棘球蚴病C57小鼠動(dòng)物模型囊泡組織中鈣磷酸調(diào)節(jié)酶濃度 對(duì)小鼠血清和囊泡囊液中CaN的含量檢測(cè)結(jié)果顯示，TAC治療組小鼠血清中的CaN含量與溶劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1A）。但TAC能夠降低囊液中CaN的含量，并且呈現(xiàn)出藥物劑量依賴性，2 mg/kg TAC治療組與4 mg/kg TAC治療組囊液中CaN含量與溶劑組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 TAC治療囊型棘球蚴病小鼠后血清中CaN含量（A）與囊液中CaN含量（B）影響

2.2 囊型棘球蚴病C57小鼠動(dòng)物模型囊泡組織中鈣離子濃度 實(shí)驗(yàn)組囊壁中Ca2+含量低于囊液中Ca2+含量，TAC治療組囊泡囊壁中的Ca2+含量與溶劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），同時(shí)，TAC治療組囊泡囊液中的Ca2+含量與溶劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但4 mg/kg TAC治療組具有增加囊壁中Ca2+含量和降低囊液中Ca2+含量趨勢(shì)（圖2）。

圖2 TAC治療囊型棘球蚴病小鼠后囊泡囊壁與囊液中Ca2+含量變化

2.3 TAC治療囊型棘球蚴病C57小鼠動(dòng)物模型血清中免疫因子含量變化 不同劑量的TAC灌胃給藥1個(gè)月后，檢測(cè)小鼠血清中免疫因子的水平。如圖3結(jié)果顯示：4 mg/kg TAC治療組與溶劑組血清中的IL-17、IFN-γ水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1 mg/kg TAC治療組與溶劑組小鼠血清中IL-10水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且小鼠血清中IL-10水平隨著TAC給藥劑量的增加有升高的趨勢(shì)；4 mg/kg和1 mg/kg TAC治療組均可增加小鼠血清中IL-17水平，并且與溶劑組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TAC治療組囊型棘球蚴病小鼠動(dòng)物模型血清中的IL-6、IL-4、TNF水平與溶劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 TAC治療囊型棘球蚴病小鼠動(dòng)物模型血清中免疫因子含量

3 討論

囊型包蟲(chóng)病是一種被忽視的疾病，多發(fā)于以畜牧業(yè)為主的地區(qū)，嚴(yán)重危害了牲畜和人體健康，中國(guó)西部、中亞、南美、地中海國(guó)家和非洲東部是高流行地區(qū)[13]?？鼓[瘤藥物[14]、廣譜抗感染藥物[15]、中草藥提取物[16]等藥物在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均被發(fā)現(xiàn)具有抗囊型包蟲(chóng)病的潛在作用，但運(yùn)用于臨床應(yīng)用的藥物甚少?；谂R床幾十年的經(jīng)驗(yàn)和大量實(shí)驗(yàn)，TAC在臨床上根據(jù)血藥濃度監(jiān)測(cè)可實(shí)現(xiàn)肝移植和腎移植患者個(gè)體化用藥[17]。目前，TAC在腫瘤研究中具有關(guān)鍵作用[18]，TAC具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡和抗增殖特性[19]。在寄生蟲(chóng)研究領(lǐng)域，40～100μmol/L依維莫司在體外干預(yù)多房棘球絳蟲(chóng)5 d和12 d后，破壞了蟲(chóng)體的結(jié)構(gòu)影響其生存活性[20]。前期研究發(fā)現(xiàn)TAC在體外能夠抑制原頭蚴和囊泡的生長(zhǎng)發(fā)育，并能夠降低囊型棘球蚴病小鼠體內(nèi)囊泡濕重[8]，但其藥理機(jī)制尚不清楚。隨著深入研究，本課題組發(fā)現(xiàn)TAC能夠顯著降低囊液中CaN的含量，并影響小鼠血清中免疫因子的含量。

在原頭蚴中有大量分化的細(xì)胞，這些細(xì)胞沉積的鈣鹽被鈣特異性結(jié)合蛋白吸收，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，需要鈣通道和鈣泵來(lái)運(yùn)輸和調(diào)節(jié)鈣的吸收[6]，以維持原頭蚴的鈣穩(wěn)態(tài)[21]，支持蠕蟲(chóng)收縮[22-23]。Li等[24]探究原頭蚴細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量是否可以作為衡量原頭蚴活力的指標(biāo)，在體外實(shí)驗(yàn)中，TAC和雷帕霉素干預(yù)后原頭蚴胞漿Ca2+濃度呈藥物劑量依賴性，并發(fā)現(xiàn)這些藥物能夠促使原頭蚴細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放，從而影響原頭蚴的活性[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAC治療囊型包蟲(chóng)病小鼠后，囊液中CaN濃度降低，且存在劑量依賴的相關(guān)性。TAC給藥治療小鼠1個(gè)月后，4mg/kg TAC顯著降低了囊液中CaN的含量，并且也降低了囊液中Ca2+的濃度。因此，本研究推測(cè)鈣調(diào)磷酸酶抑制劑TAC通過(guò)抑制鈣調(diào)磷酸蛋白酶活性，抑制細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放，并降低Ca2+通道流入細(xì)胞質(zhì)中，從而能夠抑制小鼠體內(nèi)囊泡的生長(zhǎng)發(fā)育以發(fā)揮抗囊型包蟲(chóng)病的作用。

囊型包蟲(chóng)病患者早期臨床癥狀不明顯，可在患者體內(nèi)潛伏數(shù)十年，疾病后期會(huì)引起機(jī)體免疫下調(diào)或免疫耐受[25]。IL-17在寄生蟲(chóng)感染早期發(fā)揮著抗炎抗蟲(chóng)的作用[26]，IL-17是由Th17分泌，可激活調(diào)節(jié)T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)，在囊型包蟲(chóng)病患者免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[27]。IL-17在囊型包蟲(chóng)病早期起保護(hù)作用，但后期在細(xì)粒棘球蚴感染寄生宿主體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中，不斷釋放免疫活性成分，不同程度地下調(diào)免疫效應(yīng)細(xì)胞，IL-17表達(dá)水平降低，以逃避宿主免疫攻擊的能力，能夠在體內(nèi)造成持續(xù)性感染[28]。TAC通過(guò)調(diào)節(jié)鈣磷酸調(diào)節(jié)酶影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，降低了T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌[29]。然而，在本研究發(fā)現(xiàn)4 mg/kg TAC上調(diào)了囊型棘球蚴病小鼠血清中IL-17和IFN-γ表達(dá)水平，發(fā)揮抑制囊泡在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)的作用，但其藥理機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明TAC能夠抑制囊液中CaN含量，可能參與了機(jī)體的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答起到抑制囊泡生長(zhǎng)發(fā)育的作用，且TAC能夠使小鼠血清中IL-17、IFN-γ表達(dá)水平升高，恢復(fù)免疫細(xì)胞的殺傷能力。本研究提示TAC可用于治療囊型棘球蚴病小鼠，長(zhǎng)期給藥治療仍需進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)。