包蟲病致病機(jī)制及新藥研發(fā)基礎(chǔ)研究CYP1A2基因單核苷酸多態(tài)性與囊型包蟲病關(guān)聯(lián)性分析①

亞庫甫·托合提，劉 輝，李 亮，楊 寧，林仁勇，呂國棟

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院,烏魯木齊830054）

包蟲病是棘球絳蟲的幼蟲寄生于宿主體內(nèi)引起的人獸共患寄生蟲病[1]。我國有2種包蟲病,即細(xì)粒棘球蚴引起的囊型包蟲病和由多房棘球蚴引起的泡型包蟲病，在臨床囊性包蟲病最為常見[2]。我國是全球包蟲病患者最多的國家之一，新疆維吾爾自治區(qū)是我國囊性包蟲病流行的重點(diǎn)區(qū)域[3]。西部地區(qū)受包蟲病威脅，每年經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[4]。目前如何對(duì)包蟲病進(jìn)行有效防治是一個(gè)公共衛(wèi)生問題。疾病的嚴(yán)重程度、臨床轉(zhuǎn)歸及疾病感染率由多個(gè)因素決定，這其中基因變異有著重要的作用[5]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是基因組中重要的遺傳變異之一，研究人員發(fā)現(xiàn)HLA等基因的SNP與包蟲病感染風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)性[6]。然而其他基因的SNP在包蟲病易感性和致病機(jī)制中的作用尚待研究。CYP1A2是編碼細(xì)胞色素P450超家族酶的一個(gè)基因，位于15號(hào)染色體上[7]，主要在肝細(xì)胞中表達(dá),在許多致癌物和內(nèi)源性化合物的激活和排毒過程中發(fā)揮重要作用[8]。它在維持身體健康扮演著一個(gè)重要的角色[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因遺傳變異與直腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種重大疾病發(fā)生密切相關(guān)，CYP1A2*C(rs2069514)和CYP1A2*F(rs762551)多態(tài)性是兩個(gè)最常被研究基因位點(diǎn)[10]。而目前CYP1A2基因SNP與包蟲病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性研究仍未見報(bào)道。基于此，本研究探討CYP1A2基因SNP與包蟲病患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和臨床分型的相關(guān)性，為早期識(shí)別社區(qū)風(fēng)險(xiǎn)群體提供依據(jù)，并評(píng)估其作為包蟲病患者早期診斷新型分子標(biāo)志物的可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2012年6月－2018年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷為囊型包蟲病的患者162例為病例組。選取同期來本院體檢的健康體檢者156例為對(duì)照組。兩組受檢者性別構(gòu)成、年齡相匹配、民族構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者均符合《肝兩型包蟲病診斷治療專家共識(shí)》(2015年版)[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)性別不限，民族不限。(2)患有肝包蟲病和肝臟在CT圖像中能完整并正常呈現(xiàn)的患者。(3)曾與狗等家畜有接觸史或者在日常接觸人群中具有肝包蟲患者。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)其他合并感染性疾病，代謝性疾病患者。(2)肝臟先天性不完整或功能缺陷者。本研究經(jīng)過本院倫理委員會(huì)審查通過，所有受檢者均同意參加本研究并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 EDTA抗凝管無菌采集5 mL靜脈血，存于-80℃冰箱；北京天根公司全血DNA試劑盒提取DNA，采用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測量DNA純度和濃度。

1.2.2 基因型檢測 采用TaqMan探針基因分型技術(shù)對(duì):rs2069514和rs762551多態(tài)性進(jìn)行檢測。TaqMan SNP Genotyping Assays試劑盒和TaqMan SNP Genotyping Mix試劑盒購自美國ABI公司。應(yīng)用7900 HT熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI，美國)進(jìn)行PCR反應(yīng)，CYP1A2基因位點(diǎn)rs2069514-引物序列：F：5'-TTGCAAAAATTCATCAAGCTACA-3'，R：5'-GAG TGAGGCCAGGAGTTCAA-3'。rs762551-引物(F:5'-CTGATGCGTGTTCTGTGCTT-3',R:5'-AGAGAGCCAGCGTTCATGTT-3')。PCR反應(yīng)體系為5μL，包括2×Taq-Man Master Mix試劑2.0μL,40 x TaqMan Genotyping Assay試 劑0.05μL、DNA(15～20 ng/μL)2μL、H2O 0.95μL,共50個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃10 min,95℃15 s,60℃1 min。每例樣本重復(fù)檢測3次。應(yīng)用Sequence Detector Software version 2.1(SDS version 2.1)圖像分析軟件進(jìn)行基因型分析。若只有FAM或VIC熒光增強(qiáng)的樣本，其SNP分型為純合子，若FAM和VIC同時(shí)增強(qiáng)則為雜合子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，兩組間差異性分析采用t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布的資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)。計(jì)數(shù)資料采用n表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；采用卡方檢驗(yàn)分析受檢者SNP基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。應(yīng)用非條件Logistic回歸模型分析SNP基因型與包蟲病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，并通過年齡、性別、民族等因素進(jìn)行校正，計(jì)算OR值和95%置信區(qū)間(CI)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般特征 病例組162例，男性82例、女性80例，年齡（38.4士14.0）歲，對(duì)照組156例，男性88例、女性68例，年齡（40.1士12.4）歲。病例組年齡＜30歲的47例、30～60歲的104例、＞60歲的11例,對(duì)照組年齡＜30歲的30例、30～60歲的115例、＞60歲的11例。病例組中有包蟲活力的134人，無包蟲活力的28人。

2.2 CYP1A2基因SNP不同基因型在人群中的分布 每個(gè)SNP位點(diǎn)3種基因型在兩組受檢者中的分布發(fā)現(xiàn)，SNP位點(diǎn)rs2069514 GG、GA、AA基因型在兩組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，rs762551位點(diǎn)3種基因型分布在兩組分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 CYP1A2基因SNP在病例組和對(duì)照組的分布/例（%）

2.3 CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514基因型與囊型包蟲病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性 突變型基因（GA＋AA）的人群與野生型基因(GG)人群相比，囊型包蟲病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了109%[OR（95%CI）=2.09(1.25～3.51),P=0.005]，純突變型基因（AA）的人群與包含突變型基因(GA＋GG)人群相比，囊型包蟲病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低了48%[OR（95%CI）=0.42(0.21～0.82),P=0.005]，見表2。

2.4 CYP1A2基因SNP基因型與包蟲病臨床分型的關(guān)聯(lián)性 CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514和rs762551均與包蟲病臨床分型無關(guān)聯(lián)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514基因型與囊型包蟲病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

表3 CYP1A2基因SNP基因型與包蟲病臨床分型的關(guān)聯(lián)性/例（%）

3 討論

包蟲病是由棘球絳蟲幼蟲感染引起的[11]。感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，是致病微生物、宿主與環(huán)境相互作用的結(jié)果[12]。暴露于相同的危險(xiǎn)因素下,同一地區(qū)的同一人種包蟲病發(fā)病率不同,提示宿主的遺傳多態(tài)性與包蟲病的易感性相關(guān)[13]。多項(xiàng)研究報(bào)道感染性疾病的易感性與單核苷酸多態(tài)性相關(guān)[14]，關(guān)于包蟲病感染易感性與單核苷酸多態(tài)性相關(guān)的研究報(bào)道較少。CYP1A2基因SNP與多種疾病易感性密切相關(guān)，然而它與包蟲病感染的關(guān)聯(lián)性仍未見報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因SNP與包蟲病感染風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)。

人類CYP1A2基因是高度多態(tài)的，其中中國人突變最多的SNP位點(diǎn)是rs2069514、rs762551[15]。rs2069514又稱為-3860 G＞A，位于CYP1A2基因編碼區(qū)上游區(qū)域，該SNP突變導(dǎo)致日本吸煙者CYP1A2活性顯著降低[16]。國外研究報(bào)道CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，它和膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[17]。本研究中CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514在病例組和對(duì)照組中GG、GA、AA基因型分布有差異，提示CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514與包蟲病易感性相關(guān)，包含突變型GA＋AA的人群與野生型GG人群相比，囊型包蟲病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高，純突變型AA與GA＋GG相比發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，提示rs2069514 GA基因型可能是包蟲病感染的危險(xiǎn)因素，其影響包蟲病發(fā)生的功能機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

有研究報(bào)道CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs762551與白種人得肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[18]，另有研究報(bào)道SNP位點(diǎn)rs762551與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[19]。而本研究顯示，SNP位點(diǎn)rs762551與包蟲病易感性無相關(guān)性。本研究中CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514和rs762551均與包蟲病臨床分型無關(guān)聯(lián)性，可能原因是樣本數(shù)量較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以獲得更為客觀正確的結(jié)果。

CYP1A2是重要的藥物代謝酶[20]。CYP1A2參與眾多的內(nèi)源性和外源性化合物，包括致癌物的代謝轉(zhuǎn)化，以及它在各種疾病發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。CYP1A2表達(dá)存在較大的個(gè)體差異[10]，這跟藥物代謝有關(guān)[21]?，F(xiàn)有治療包蟲病的阿苯達(dá)唑等藥物的利用效率低[3]，CYP1A2參與阿苯達(dá)唑的代謝過程[22]，提示,開展阿苯達(dá)唑藥物代謝額濃度與CYP1A2基因SNP的關(guān)聯(lián)性研究很有必要，對(duì)臨床指導(dǎo)阿苯達(dá)唑治療包蟲病具有一定的意義。

目前包蟲病易感性的研究主要集中在免疫方面[23]。本研究發(fā)現(xiàn)了CYP1A2 SNP與包蟲病感染風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性，增加了SNP與包蟲病易感性的一個(gè)研究思路。人類基因組序列已揭示約107個(gè)人類CYP基因：59個(gè)活躍基因和約48個(gè)假基因，在編碼異源生物代謝酶的基因（CYP1-3）中，除了相對(duì)保守的CYP1A1和CYP2E1外，其他基因也具有大量的SNP位點(diǎn)。本研究僅探索了CYP1A2基因rs2069514和rs762551與囊性包蟲病的相關(guān)性，其他SNP位點(diǎn)也具有一定研究價(jià)值,尚待今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，CYP1A2基因SNP位點(diǎn)rs2069514與包蟲病易感性相關(guān)。在DNA水平研究包蟲病易感性,有助于了解包蟲病的發(fā)病機(jī)制，為包蟲病未來的基因診斷以及預(yù)防奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。