磷酸氯喹片微生物限度檢查方法適用性研究

李文靖，張帆，凌曉敏

廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510000

氯喹是一種4-氨基喹啉類衍生物，在1934 年由漢斯.安德薩格（Hans.Andersag）發(fā)明［1］，隨后開始廣泛應(yīng)用于瘧疾、炎癥和病毒感染性疾?。?］。磷酸氯喹是氯喹的磷酸鹽，有著70 年抗瘧歷史，但隨著近年來醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，瘧疾在中國已基本被消滅，國內(nèi)許多藥企已很少生產(chǎn)該藥，甚至停產(chǎn)［3］，新冠肺炎發(fā)生后，專家組發(fā)現(xiàn)磷酸氯喹對新冠肺炎患者能起到有效治療，能降低重癥患者病亡率，阻止輕癥向重癥發(fā)展，隨后納入新冠肺炎治療方案（試行第六版）［4］。磷酸氯喹通過干擾核內(nèi)體酸化抑制病毒入侵而起到抗病毒的作用［5］，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其治療新冠肺炎病毒不良反應(yīng)較輕［6-7］，并且加速普通新型冠狀病毒肺炎患者核酸轉(zhuǎn)陰時間較為顯著［8］。藥企迅速復(fù)產(chǎn)磷酸氯喹的片劑，爭取在最短時間內(nèi)通過檢測投入臨床使用，但由于停產(chǎn)的時間較長，該藥的微生物限度檢查方法并未及時更新，現(xiàn)根據(jù)2015 版《中國藥典》四部［9］非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法，建立磷酸氯喹片的微生物檢查方法，對4個廠家7批產(chǎn)品進行方法適用性試驗，結(jié)果表明方法準確、可靠。

1 實驗材料

1.1 樣品

磷酸氯喹片，A 廠家批號：200201、200205、200216；B 廠家批號：T00001、T00005；C 廠家批號：20 200214；D 廠家批號：KH06710A，規(guī)格均為0.25 g；A、B、C 為國內(nèi)藥企，D 為國外藥企。

1.2 儀器

BSA2202S 電子天平（SARTORIUS，百分之一），JY-A 勻漿儀（臺州椒江五星試壓），Lab dancer混合器（IKA），1379 型生物安全柜（Thermo），MIR-254-PC 型生化培養(yǎng)箱（松下），CD-B33 型水浴箱（Julabo）。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號：1806062），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號：1905062），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號：1083591），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號：1080971），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：1075425），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC，批號：1069751），以上培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果均符合《中國藥典》2015 版規(guī)定。

1.4 菌種

大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、銅 綠 假 單 胞 菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，均來源于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

按照《中國藥典》2015 版四部要求，取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子新鮮培養(yǎng)物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL 含菌量為103～104cfu 的菌懸液，作為計數(shù)用。取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液，作為控制菌檢查用。

2.2 供試液制備

取本品10 g，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀粉碎，混勻，制成1∶10的供試液，再用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1∶20、1∶50 的供試液。

2.3 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 常規(guī)平皿法試驗組：取1∶10 的供試液各10 mL，分別加入2.1 項下計數(shù)用的5 種試驗菌懸液0.1 mL，搖勻，取1 mL 置平皿中，注入TSA 約20 mL，混勻，待凝固后倒置培養(yǎng)，每個菌株平行制備2 個平皿，計數(shù)，取菌落數(shù)平均值。

菌液組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液各10 mL，分別加入5 種試驗菌懸液0.1 mL，取1 mL 置平皿中，注入TSA 約20 mL，混勻，待凝固后倒置培養(yǎng)，每個菌株平行制備2 個平皿，計數(shù)，取菌落數(shù)平均值。

供試品對照組：取1∶10 的供試液，以稀釋液代替菌懸液同試驗組操作。

計算回收比值：各菌株回收比值=（試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)）÷菌液組平均菌落數(shù)。見表1。

表1 顯示，B、D 廠家3 次試驗各菌株的回收均在0.5～2 范圍內(nèi)，需氧菌總數(shù)檢查可用常規(guī)平皿法檢查。而A、C 廠家用1∶10 平皿法檢查，不能消除本品對銅綠假單胞菌或枯草芽孢桿菌的抑制作用，需對供試液進一步稀釋后再試驗。

2.3.2 稀釋平皿法試驗組：分別取A、C 廠家1∶20、1∶50 的供試液各10 mL，分別加入5 種試驗菌懸液0.1 mL，搖勻，取1 mL 置平皿中，注入TSA 約20 mL，混勻，待凝固后倒置培養(yǎng)，平行制備2 個平皿，計數(shù)，取菌落數(shù)平均值。

供試液對照組及菌液組按2.3.1 項下同法操作，計算各菌株回收比值，見表2。

表1 需氧菌總數(shù)采用常規(guī)平皿法的回收比值

表2 顯示，A 廠家采用1 ∶50 供試液，C 廠家采用1∶20 供試液，3 次試驗各菌株的回收均在0.5～2范圍內(nèi)。兩個廠家的需氧菌總數(shù)計數(shù)可采用供試液稀釋法進行檢查。

2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)

試驗組：取1∶10 的供試液各10 mL，分別加入白色念珠菌、黑曲霉孢子2 種試驗菌懸液0.1 mL，搖勻，取1 mL 置平皿中，注入SDA 約20 mL，混勻，待凝固后倒置培養(yǎng)，每個菌株平行制備2個平皿，計數(shù)，取菌落數(shù)平均值。

菌液組：取pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液各10 mL，分別加入2 種試驗菌懸液0.1 mL，取1 mL 置平皿中，注入SDA 約20 mL，混勻，待凝固后倒置培養(yǎng)，每個菌株平行制備2 個平皿，計數(shù)，取菌落數(shù)平均值。

供試品對照組：取1∶10 的供試液，以稀釋液代替菌懸液同試驗組操作。

計算回收比值：各菌株回收比值=（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)。結(jié)果見表3。

表2 需氧菌總數(shù)稀釋法的回收比值

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿法的回收比值

表3 顯示，4 個廠家3 次試驗2 個菌株的回收比值均在0.5～2 范圍內(nèi)，表明本品的霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)可用常規(guī)平皿法檢查。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

磷酸氯喹片為口服給藥片劑，按照《中國藥典》2015 版四部通則1107 要求控制菌應(yīng)檢查大腸埃希菌。

大腸埃希菌檢查：取1∶10 供試液10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的大腸埃希菌菌懸液，分別接種至100 mL、200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查。結(jié)果見表4。

表4 大腸埃希菌檢查結(jié)果

表4 顯示，A、B、C 三個廠家的大腸埃希菌檢查需采用培養(yǎng)基稀釋法（200 mL/瓶），D 廠家的大腸埃希菌檢查采用常規(guī)法（100 mL/瓶）。

3 討論

對4 個廠家7 批樣品進行微生物方法適用性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）B、D 兩個廠家需氧菌總數(shù)采用常規(guī)平皿法時，各菌株的回收比值均在0.5～2.0 之間，說明產(chǎn)品在檢驗條件下沒有抑菌性，對需氧菌總數(shù)檢出的干擾可以忽略。而A、C 兩個廠家采用常規(guī)平皿法時，對銅綠假單胞菌或枯草芽孢桿菌有抑菌作用，回收率達不到藥典要求，需對供試液作進一步稀釋，采用1∶20、或1∶50 供試液，才能去除樣品對需氧菌的干擾。國內(nèi)3 個廠家方法均不相同，其中一家跟國外的一致，經(jīng)紫外分光光度計測定，磷酸氯喹含量均在標示量的94%～100%之間，符合標準規(guī)定，結(jié)果顯示3 個廠家成品中磷酸氯喹的含量相差甚少，與造成這種差異的關(guān)系不大，可能與廠家不同的制劑工藝、原輔料來源有關(guān)，制劑工藝與輔料是影響藥品制劑穩(wěn)定性的因素，另外，國外有文獻分析了尼日利亞7個品牌的磷酸氯喹片，發(fā)現(xiàn)沒有一個可以說在物理和化學(xué)上是等效的［10］，說明了不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量存在差異。這也是藥典強調(diào)同一品種不同廠家的產(chǎn)品，微生物限度檢查法均需做方法適用性試驗的原因。（2）4 個廠家的霉菌及酵母菌計數(shù)均采用常規(guī)法，表明磷酸氯喹片對白色念珠菌和黑曲霉沒有抑制作用，控制菌檢查大腸埃希菌僅有D 廠家采用常規(guī)法，其余3 家廠家需采用培養(yǎng)基稀釋法。綜上所述，磷酸氯喹片需氧菌總數(shù)計數(shù)可采用常規(guī)平皿法，或需將供試液進一步稀釋檢查，霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)用常規(guī)平皿法，檢查控制菌用培養(yǎng)基稀釋法檢查。建議對本品進行微生物限度檢查時，如未做方法適用性試驗，需氧菌總數(shù)用1∶50 稀釋液作為第一稀釋級進行檢查，方法準確、可靠,適用于磷酸氯喹片的微生物檢查。