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    橋聯(lián)黃素再生NAD+耦聯(lián)L-谷氨酸脫氫酶高效產(chǎn)α-酮戊二酸

    2021-04-14 04:58:24譚卓濤付靜雯張肖旺韓耀穎付亞萍朱晨杰應(yīng)漢杰
    生物加工過程 2021年2期
    關(guān)鍵詞:耦聯(lián)脫氫酶梭菌

    譚卓濤,付靜雯,張肖旺,韓耀穎,付亞萍,朱晨杰,應(yīng)漢杰

    (南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 211800)

    α-酮戊二酸(α-KG)是一種重要的二羧酸:在三羧酸循環(huán)中參與氨基酸的形成,在氨基酸代謝中參與氮的運(yùn)輸;同時(shí),α-KG在有機(jī)合成如雜環(huán)構(gòu)建,藥物領(lǐng)域如保健品、傷口愈合成分中都有廣泛的應(yīng)用[1]。常見的α-KG的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法?;瘜W(xué)合成α-KG需要經(jīng)過多步反應(yīng),且合成過程使用的氰化物與伴隨產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物極度污染環(huán)境[2]。微生物發(fā)酵以正鏈烷烴,或者乙醇、甘油等為底物,由于各種副產(chǎn)物的分離提高了生產(chǎn)成本,仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段[3-4]。生物轉(zhuǎn)化法尤其是酶催化具有以下特點(diǎn):第一,酶催化化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性高,有利于提高生產(chǎn)效益;第二、酶催化反應(yīng)條件溫和,常在常溫常壓和水中進(jìn)行,更加安全且無污染。綜上所述,酶法生產(chǎn)α-KG具有很好的前景。

    工業(yè)上L-谷氨酸產(chǎn)能過剩(2018年,我國(guó)L-谷氨酸的產(chǎn)量大約250萬t),因此以廉價(jià)的L-谷氨酸為原料生產(chǎn)α-KG是極有優(yōu)勢(shì)的。L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、L-氨基酸氧化酶(LAAO)、L-谷氨酸脫氫酶(L-GluDH)被報(bào)道可用于酶法轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG。其中,來自奇異變形菌(Proteusmirabilis)的LAAO對(duì)L-谷氨酸的底物特異性差且酶活受到產(chǎn)物α-KG的嚴(yán)重抑制[5],來自鏈霉菌(Streptomycesspecies)的LGOX酶活較低,需要優(yōu)化異源表達(dá)所用的載體和宿主以期提高其表達(dá)量及酶活[6]。L-GluDH可以催化L-谷氨酸和α-KG間的可逆反應(yīng),因此在L-GluDH催化L-谷氨酸氧化脫氨過程中需要構(gòu)建氧化型煙酰胺輔因子NAD+再生過程[7-8]以降低成本的同時(shí)推動(dòng)反應(yīng)朝生成α-KG的方向進(jìn)行,最常用的方法是耦聯(lián)NADH氧化酶[9],但雙酶耦聯(lián)時(shí)對(duì)酶促反應(yīng)速率的匹配要求限制了其大規(guī)模應(yīng)用。最近研究發(fā)現(xiàn)金屬有機(jī)配合物如銠配合物[10]、鐵卟啉[11]等可以作為NADH氧化酶類似物再生NAD(P)+,但由于金屬有機(jī)配合物具有成本高、易導(dǎo)致酶失活、后處理比較困難等缺點(diǎn),不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。課題組前期的工作發(fā)現(xiàn),人工黃素類似物——橋聯(lián)黃素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基異咯嗪氯化物(F4)能高效再生NAD(P)+,且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、水溶性好、不影響酶活[12]。因此,筆者擬采用F4再生NAD+耦聯(lián)L-谷氨酸脫氫酶催化L-谷氨酸至α-KG,技術(shù)路線見圖1。通過單因素考察結(jié)合響應(yīng)面法,以α-KG收率為目標(biāo),優(yōu)化酶促反應(yīng)條件。

    圖1 橋聯(lián)黃素再生煙酰胺輔因子(NAD+)耦聯(lián) L-谷氨酸脫氫酶產(chǎn)α-KGFig.1 The coupled system of enzymatic converting sodium L-glutamate monohydrate(MSG) to α-KG employing F4 for NAD+ regeneration

    1 材料與方法

    1.1 原料

    L-谷氨酸鈉和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)(分析純),Aladdin公司;α-酮戊二酸鈉鹽(分析純),Sigma公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3、NaHCO3和NaCl(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(分析純)、胰蛋白胨、酵母提取物和卡那霉素,生工生物工程(上海)有限公司;鹽酸(分析純),西隴化工股份有限公司。

    1.2 酶的來源

    過氧化氫酶及來自變形桿菌(Proteusspecies)的L-谷氨酸脫氫酶,Sigma公司;來自艱難梭菌(Clostrdiumdifficile)CICC 22951的L-谷氨酸脫氫酶由實(shí)驗(yàn)室篩選得到。

    1.3 橋聯(lián)黃素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基異咯嗪氯化物(F4)的合成

    參照文獻(xiàn)[12]的方法制備橋聯(lián)黃素。

    1.4 來源于艱難梭菌(Clostrdium difficile)的L-谷氨酸脫氫酶的制備

    參照文獻(xiàn)[13]的方法制備來源于艱難梭菌的L-谷氨酸脫氫酶:構(gòu)建大腸桿菌重組菌BL21(DE3)-pET28a-GluDH,在含0.1%卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(37 ℃,200 r/min,12 h)至OD600為0.6~0.8,加入IPTG(終濃度為0.6 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶(25 ℃,200 r/min,24 h),經(jīng)破碎、離心、過濾、Ni-NTA純化柱純化、超濾過程后得到純酶液,測(cè)定酶活后使用。

    1.5 橋聯(lián)黃素再生煙酰胺類輔因子與L-谷氨酸脫氫酶耦聯(lián)體系

    以10 mL反應(yīng)體系為例:15 mmol/L L-谷氨酸鈉、1 mmol/L NAD+、1 mmol/L F4,pH 9三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液,過氧化氫酶50 U/mL,加入L-谷氨酸脫氫酶5 U/mL啟動(dòng)反應(yīng),反應(yīng)液與外界空氣相通。分別取反應(yīng)4、8、12和24 h的反應(yīng)液 200 μL,加入800 μL水稀釋,過0.22 μm水系濾膜后利用液相檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。

    1.6 分析方法

    1)谷氨酸脫氫酶酶活測(cè)定。1 mL反應(yīng)體系如下:3 mmol/L L-谷氨酸鈉、0.2 mmol/L NAD+、100 mmol/L、Tris-HCl緩沖溶液(pH 8),加入適量L-谷氨酸脫氫酶酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)340 nm處NADH吸光度的變化ΔA。酶活定義:在L-谷氨酸氧化反應(yīng)中每分鐘內(nèi)催化生成1 μmol NADH所需的酶量為一個(gè)單位,酶活計(jì)算見式(1)。

    (1)

    式中:ΔA表示1 min內(nèi)吸光值的變化;V表示反應(yīng)體系總體積,mL;6 220 為摩爾消光系數(shù),L/(mol·cm);l表示光程為1 cm。

    2)α-酮戊二酸的檢測(cè)。采用HPLC法定量分析反應(yīng)產(chǎn)物α-KG,色譜條件如下:有機(jī)酸柱Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm),流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4,進(jìn)樣量10 μL,流速0.6 mL/min,柱溫35 ℃,紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)為205 nm,α-KG的保留時(shí)間為8.674 min。

    3)α-酮戊二酸收率計(jì)算。利用外標(biāo)法定量分析液相檢測(cè)結(jié)果,配制一系列質(zhì)量濃度為0.2~2.7 g/L的α- KG標(biāo)準(zhǔn)溶液,檢測(cè)不同質(zhì)量濃度下α-KG對(duì)應(yīng)的峰面積,得到峰面積對(duì)α-KG濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同反應(yīng)時(shí)間的峰面積所對(duì)應(yīng)的α-KG濃度,α-KG收率的計(jì)算見式(2)。

    α-KG收率=HPLC外標(biāo)法測(cè)得的產(chǎn)物濃度/L-谷氨酸的起始濃度 ×100%

    (2)

    2 結(jié)果與討論

    2.1 單因素考察

    由于酶對(duì)特定底物的活性與酶的來源相關(guān),同一種酶的酶活受緩沖液類型的影響,且L-GluDH的活性還受到產(chǎn)物α-KG、NADH的抑制[14],而F4的用量會(huì)間接影響體系內(nèi)NADH的濃度,體系pH對(duì)酶的活性及產(chǎn)物α-KG的穩(wěn)定性也有顯著的影響,因此需要考察L-GluDH的來源、緩沖溶液類型、NADH及F4用量、體系pH對(duì)α-KG收率的影響。

    2.1.1 來源不同的L-谷氨酸脫氫酶對(duì)反應(yīng)的影響

    來自艱難梭菌的L-GluDH受到的抑制作用較小[11],因此對(duì)比了來自艱難梭菌(Clostrdiumdifficile)的L-GluDH以及商品化的來自變形桿菌(Proteusspecies)的L-GluDH與F4耦聯(lián)時(shí)的α-KG收率,結(jié)果見圖2。由圖2可知:來自艱難梭菌的L-GluDH顯示出高的催化活性,因此選用來自艱難梭菌的L-GluDH作為酶源,F(xiàn)4耦聯(lián)來自艱難梭菌的L-GluDH反應(yīng)24 h α-KG收率達(dá)92%左右(產(chǎn)量2.02 g/L),高于NADH氧化酶、三價(jià)鐵卟啉作為再生催化劑時(shí)的結(jié)果,初步證實(shí)F4作為NAD+再生催化劑耦聯(lián)L-GluDH具有很大優(yōu)勢(shì)。

    圖2 L-谷氨酸脫氫酶的來源對(duì)α-KG收率的影響Fig.2 Effects of the source of L-glutamate dehydrogenase on yield of α-ketoglutarate

    2.1.2 不同類型緩沖液、NAD+的濃度、橋聯(lián)黃素濃度、pH對(duì)反應(yīng)的影響

    考察不同類型緩沖液、NAD+的濃度、橋聯(lián)黃素濃度、pH對(duì)α-KG收率的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可知:在pH緩沖范圍不同的檸檬酸緩沖(CPBS)、K2HPO4/KH2PO4緩沖(KPi)、羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖(Tris-HCl)、碳酸鹽緩沖(CBS)條件下,L-GluDH催化L-谷氨酸的能力不同,Tris-HCl與L-GluDH的相容性最好,因此選擇Tris-HCl 作為緩沖液。

    當(dāng)NAD+的濃度為1 mmol/L時(shí),α-KG收率達(dá)到最大值。隨著NAD+濃度的增加,α-KG收率反而在明顯下降,這是因?yàn)樯傻腘ADH沒有立刻被F4再生成NAD+,導(dǎo)致NADH濃度過高,從而抑制了L-GluDH的活性,因此選擇NAD+的濃度為1 mmol/L繼續(xù)探究F4的用量。

    當(dāng)F4的濃度為1 mmol/L時(shí),α-KG收率相對(duì)較高,當(dāng)繼續(xù)增加F4用量,α-KG收率顯著下降,說明F4具有通過氧化NADH到NAD+來降低NADH對(duì)L-GluDH抑制的作用,但過高的F4可能也會(huì)對(duì)L-GluDH產(chǎn)生抑制作用。因此需要繼續(xù)探究NAD+和F4的使用比例,找到α-KG收率變化的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的NAD+濃度和F4濃度。

    當(dāng)pH為8或9時(shí),α-KG收率都較高,pH為9時(shí),中間反應(yīng)過程明顯比pH 8時(shí)的快,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),由于α-KG在堿性強(qiáng)的條件下容易分解,α-KG收率增高幅度逐漸變慢。

    圖3 不同因素對(duì)α-KG收率的影響Fig.3 Effects of different factor on yield of α-KG

    2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

    為了能更好地滿足工業(yè)化生產(chǎn)α-KG的要求,使用響應(yīng)面分析法對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken design[15]模塊,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn),考察NAD+的濃度(A)、F4的濃度(B)和pH(C)對(duì)α-KG收率的影響,根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行15組平行實(shí)驗(yàn)(表1),以α-KG收率為響應(yīng)值進(jìn)行回歸模擬得到二次回歸方程:

    產(chǎn)率=95.57+2.20A+9.01B+4.66C-3.65AB-4.10AC-2.32BC-13.15A2-13.32B2-11.22C2。

    方差分析(ANOVA)和F檢驗(yàn)的結(jié)果見表2。由表2可知:模型P<0.05,達(dá)到顯著水平,而失擬項(xiàng)P=0.066 7>0.05,模型失擬不顯著,說明該方程擬合度高,可用于α-KG收率的分析預(yù)測(cè)。從P值大小可以看出:一次項(xiàng)B、C,交互項(xiàng)AB、AC,二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)α-KG收率影響顯著,說明各因素對(duì)α-KG收率影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,且其中F4濃度(B)對(duì)α-KG收率有很大的影響(P=0.000 2<0.05)。

    考察因素間交互作用對(duì)α-KG收率的影響,結(jié)果見圖4~6。由圖4可知:NAD+和F4濃度對(duì)α-KG收率影響顯著,且在一定范圍內(nèi)α-KG收率隨著NAD+和F4的濃度增高而增高,過高的NAD+和F4濃度都不利于α-KG的生產(chǎn),與單因素試驗(yàn)的結(jié)果相符合;pH過小或者過大都對(duì)α-KG收率都是不利的,在略偏堿性的條件下有利于α-KG的生產(chǎn)和穩(wěn)定。同時(shí)由等高線圖可知,回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn),即為α-KG最高收率,利用回歸方程預(yù)測(cè)最高α-KG收率為97.4%(產(chǎn)量2.14 g/L),對(duì)應(yīng)的工藝參數(shù)條件:NAD+濃度1 mmol/L,F(xiàn)4濃度1.16 mmol/L,pH 8.17,修正取整后(NAD+濃度1 mmol/L,F(xiàn)4濃度1 mmol/L,pH 8)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),24 h后α-KG的收率達(dá)到96.4%(產(chǎn)量2.11 g/L),與模型預(yù)測(cè)基本一致。相比文獻(xiàn)[9]報(bào)道的NADH氧化酶酶法再生NAD+與L-谷氨酸脫氫酶耦聯(lián)生產(chǎn)α-KG,收率提高了15%左右。在最優(yōu)條件下,在1 L的氣升式發(fā)酵罐中放大反應(yīng),利用來自艱難梭菌的L-谷氨酸脫氫酶在Tris-HCl緩沖液環(huán)境下催化15 mmol/L的L-谷氨酸進(jìn)行氧化脫氨反應(yīng),24 h后α-KG的收率為92%(產(chǎn)量2.02 g/L),說明該模型能夠較為正確地預(yù)測(cè)出各因素對(duì)α-KG收率的影響,以用于指導(dǎo)α-KG的工業(yè)化生產(chǎn)。

    表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    表2 回歸方程的方差分析

    圖4 NAD+濃度和F4濃度對(duì)α-KG收率的影響Fig.4 Effects of NAD+ and F4 concentration on yield of α-KG

    圖5 NAD+濃度和pH對(duì)α-KG收率的影響Fig.5 Effects of NAD+ concentration and pH value on yield of α-KG

    圖6 F4濃度和pH對(duì)α-KG收率的影響Fig.6 Effects of F4 concentration and pH value on yield of α-KG

    3 結(jié)論

    橋聯(lián)黃素7-三氟甲基-N1,N10-乙烯基異咯嗪氯化物(F4)能高效再生NAD(P)+,且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、水溶性好、不影響酶活,利用F4耦聯(lián)L-谷氨酸脫氫酶,構(gòu)建新型α-KG生產(chǎn)體系。通過單因素考察響應(yīng)面法優(yōu)化反應(yīng)條件,得出最佳參數(shù):NAD+濃度1 mmol/L、F4濃度1 mmol/L、pH 8,在底物L(fēng)-谷氨酸濃度為15 mmol/L條件下放大反應(yīng)24 h后,α-KG的收率為92%(產(chǎn)量2.02 g/L),同時(shí)NAD+的用量從2 mmol/L降低至1 mmol/L,降低了生產(chǎn)成本,該耦聯(lián)體系為得到高產(chǎn)量的α-KG提供了一種新途徑。同時(shí)再次證明,F(xiàn)4有望與更多依賴NAD+的氧化還原酶反應(yīng)體系兼容,如與甘油脫氫酶耦聯(lián)催化甘油至高附加值的1,3-二羥丙酮,具有廣闊的應(yīng)用前景。

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