基于UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)藍(lán)莓中花青苷類物質(zhì)的定性定量分析

魏海蓉，易錫斌，譚鉞，徐麗，宗曉娟，朱東姿，劉慶忠，王甲威，張力思

（1.山東省果樹研究所/山東省果樹生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000；2.濟(jì)南磐升生物技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南 250102）

藍(lán)莓屬于杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）的一種漿果類果樹，富含花青苷、熊果酸、黃酮等抗氧化物質(zhì)，具有改善視力、增強(qiáng)記憶力、軟化血管、抗癌等多種保健功能，倍受消費(fèi)者的青睞［1，2］。藍(lán)莓果實(shí)富含的花青苷是一大類非常重要的功能性成分，隨著對(duì)其生物學(xué)活性功能研究的不斷深入，藍(lán)莓花青苷越來越多地被開發(fā)應(yīng)用于食品、藥品和化妝品領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展前景。

花青苷是一種廣泛存在于植物體中的水溶性天然色素，屬于一類具有多個(gè)酚羥基的天然黃酮類化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、改善血液循環(huán)和預(yù)防心血管疾病等多種生物活性［3-5］。花青苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)功能，不同種類花青苷因與花青素結(jié)合的糖基種類、位置和數(shù)量不同，結(jié)構(gòu)存在差異，具有不同的生物學(xué)活性。因此，研究藍(lán)莓果實(shí)花青苷類物質(zhì)的組成和含量，對(duì)綜合開發(fā)藍(lán)莓相關(guān)產(chǎn)品具有重要意義。

目前人們對(duì)花青苷代謝途徑及調(diào)控機(jī)理的研究較為深入，但是對(duì)其發(fā)揮生理功能活性所涉及的分子結(jié)構(gòu)及花青素的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)過程等方面還比較少［6，7］。目前常用的花青苷檢測(cè)方法主要有紫外可見分光光度法、液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［8-10］。其中，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在快速分離、準(zhǔn)確定性和靈敏度等方面較前兩者更具有優(yōu)勢(shì)。本研究以超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)對(duì)3個(gè)藍(lán)莓品種成熟果實(shí)中花青苷組分的種類和含量進(jìn)行比較分析，旨在為藍(lán)莓優(yōu)異種質(zhì)挖掘和藍(lán)莓花青苷產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本試驗(yàn)所用高灌藍(lán)莓品種‘藍(lán)豐’（Vaccinium corymbosum‘Bluecrop’）和‘喜來’（V.corymbosum‘Sierra’）以及兔眼藍(lán)莓品種‘藍(lán)冠’（Vaccinium ashei Read‘Lan Guan’）的成熟果實(shí)均采自山東省果樹研究所試驗(yàn)基地。從健株上隨機(jī)選取無病蟲害、無機(jī)械損傷、充分發(fā)育成熟的果實(shí)，切碎，液氮速凍，存于-80℃冰箱，用于測(cè)定。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純?；ㄇ嘬諛?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括飛燕草素-3-半乳糖苷、錦葵素-3-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷、牽牛花素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 4500液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；超純水儀；Phenomenex kinetex C18色譜柱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；TH-100BQX型數(shù)控超聲波清洗機(jī)。

1.3 花青苷提取

取鮮樣0.5 g，加液氮研磨，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入甲醇-0.1%甲酸（2∶8，V/V）提取液15 mL，室溫下超聲波提取10 min，然后置于4℃條件下浸提24 h，再4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，35℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇-0.1%甲酸水溶液回溶，并定容至2 mL。采用0.22μm有機(jī)微孔濾膜過濾后裝入2 mL進(jìn)樣瓶，待上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex Kinetex（100 mm×4.6 mm，2.6μm），流動(dòng)相A 0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B乙腈，進(jìn)樣量5μL，流速1.0 mL/min，柱溫35℃。采用梯度洗脫：0～1.0 min，5% B；1.0～2.5 min，5% ～50% B；2.5～3.8 min，50%～70% B；3.8～5.0 min，70%～90% B；5.0～6.0 min，90% B；6.0～6.2 min，90% ～5%B；6.2～8.0 min，5% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)：氣簾氣241.325 kPa，離子源電壓5 500.00 V，離子源溫度550.00℃，離子源電離反應(yīng)氣體379.225 kPa，脫溶劑氣體379.225 kPa，碰撞池氣體48.265 kPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

花青苷類物質(zhì)在C18色譜柱上能夠得到很好的分離［11，12］。因此本試驗(yàn)選用Phenomenex Kinetex C18（100 mm×4.6 mm，2.6μm）色譜柱，根據(jù)花青苷類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、酸性條件下較為穩(wěn)定、極性較強(qiáng)且差異較小的特性，對(duì)流動(dòng)相組成、流速、梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。確定流動(dòng)相A采用弱酸性的0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B采用乙腈，進(jìn)樣量5μL，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，梯度洗脫。在此條件下能夠較好地分離和檢測(cè)出11種化合物?？傠x子流圖見圖1。

圖1 花青苷類物質(zhì)的總離子流圖

2.2 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

在電噴霧正離子模式下對(duì)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子Q1掃描。飛燕草素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、牽?；ㄋ?3-半乳糖苷、錦葵素-3-阿拉伯糖苷、牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷11種化合物的母離子均以［M+H］+或［M］+形式存在。確定母離子后，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描。通過對(duì)二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如錐孔電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，確定每種物質(zhì)選擇3個(gè)信號(hào)較強(qiáng)子離子與母離子組成檢測(cè)離子對(duì)，采用MRM檢測(cè)模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。試驗(yàn)表明，DP電壓35～90 V時(shí)Q1豐度幾乎不變；DP較高時(shí)異構(gòu)體的豐度有所差異，為了不影響異構(gòu)體的豐度，選擇40 V作為最終DP電壓，碰撞池入口電壓（EP）、出口電壓（CXP）分別為12、9 V。11種花青苷在色譜柱上的相對(duì)保留時(shí)間、定性離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下11種花青苷類物質(zhì)的保留時(shí)間及定性離子對(duì)參數(shù)

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

采用甲醇-0.1%甲酸溶液將飛燕草素-3-半乳糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、錦葵素-3-半乳糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷、牽?；ㄋ?3-半乳糖苷、錦葵素-3-阿拉伯糖苷、牽牛花素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷11種花青苷標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為0、10、30、50、100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用優(yōu)化好的液相色譜和質(zhì)譜條件依次進(jìn)行測(cè)定。以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示，11種化合物的線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.9950～0.9996，表明各化合物在0～100μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，本方法能夠滿足檢測(cè)需求。取被多次提取花青苷后的樣品殘?jiān)鳛榭瞻谆|(zhì)，采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物的方法，以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果見表2。

表2 11種花青苷的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 不同藍(lán)莓品種的花青苷種類和含量分析

采用本試驗(yàn)建立的方法對(duì)高灌藍(lán)莓品種‘藍(lán)豐’和‘喜來’以及兔眼藍(lán)莓品種‘藍(lán)冠’的花青苷類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，從‘喜來’和‘藍(lán)冠’中分別檢測(cè)出11種花青苷類物質(zhì)，從‘藍(lán)豐’中檢測(cè)出10種花青苷類物質(zhì)（表3）。不同品種間各花青苷類物質(zhì)的含量存在明顯差異?！{(lán)豐’的總花青苷含量為3 460.8 mg/kg，其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高，其次是飛燕草素-3-葡萄糖苷；‘喜來’的總花青苷含量為3 194.6 mg/kg，其中含量最高的是飛燕草素-3-葡萄糖苷，其次是錦葵素-3-半乳糖苷；‘藍(lán)冠’的總花青苷含量為4 866.6 mg/kg，其中含量最高的是矢車菊素-3-葡萄糖苷，其次是錦葵素-3-阿拉伯糖苷。

表3 不同藍(lán)莓品種的花青苷種類及含量

3 結(jié)論

本研究以‘藍(lán)豐’‘喜來’和‘藍(lán)冠’為試材，建立了利用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)藍(lán)莓中花青苷類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。該方法快速、準(zhǔn)確，在0～100μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r值為0.9950～0.9996，能夠滿足檢測(cè)需求。利用該方法分別從‘喜來’和‘藍(lán)冠’中鑒定出11種花青苷，從‘藍(lán)豐’中鑒定出10種花青苷，且3個(gè)品種間各種花青苷類物質(zhì)含量存在明顯差異，主要花青苷類物質(zhì)種類和含量也存在一定差異——‘藍(lán)豐’中以錦葵素-3-阿拉伯糖苷和飛燕草素-3-葡萄糖苷含量較高，‘喜來’中以飛燕草素-3-葡萄糖苷和錦葵素-3-半乳糖苷含量較高，‘藍(lán)冠’中則以矢車菊素-3-葡萄糖苷和錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量較高。本研究結(jié)果可為藍(lán)莓優(yōu)異種質(zhì)挖掘及富含花青苷的新品種選育提供理論依據(jù)。