電壓門控鈣離子通道藥物研究進展

馬卓伊，戚微巖，高新梅，徐寒梅，胡加亮

（中國藥科大學 江蘇省合成多肽藥物發(fā)現(xiàn)與評價中心，江蘇 南京 211198）

電壓門控離子通道是一類重要的膜蛋白家族，其功能構(gòu)象對細胞膜電位的變化很敏感，通過允許陽離子通過它們的成孔亞基，再沿電化學梯度向下流動而參與細胞信號傳遞[1]。電壓門控鈣離子通道（voltage-gated calcium channels，VGCC）具有共同的架構(gòu)和3 種與電壓相關(guān)的不同功能狀態(tài)：封閉或靜息通道、激活或開放通道、失活通道。在去極化時，這些通道以毫秒級的速度由靜息狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，然后快速失活，在復極化時返回靜息狀態(tài)[2]。與其他電壓門控離子通道不同的是，VGCC 與許多細胞反應有關(guān)，包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉收縮和基因表達。因此，VGCC 能將細胞膜上的電信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)具有重要生理意義的鈣離子瞬態(tài)[1,3]。

VGCC 是由4 ～ 5 個亞基組成的復合蛋白，這些亞基由多個基因編碼，在控制鈣離子進出的過程中發(fā)揮著不同的作用，根據(jù)α1 亞基的差異分為10 個亞型。各種亞型VGCC 在細胞信號傳導中發(fā)揮著不同的作用：CaV1 亞家族啟動神經(jīng)元的收縮、分泌、調(diào)控基因表達和突觸的轉(zhuǎn)運和整合；CaV2 亞家族主要負責在快突觸中啟動突觸傳遞；CaV3 亞家族對于節(jié)律放電細胞（如心肌細胞和丘腦神經(jīng)元）的動作電位的重復放電非常重要[4]。各種亞型VGCC 的功能障礙可能導致從心血管疾病到神經(jīng)和精神狀況的病理、生理學改變，如癲癇、疼痛和自閉癥等。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子通道阻滯劑已被成功用于治療失神性癲癇，并正在成為疼痛、帕金森病、成癮和焦慮等疾病的潛在治療藥物。此外，人類鈣離子通道基因的突變還與癲癇、偏頭痛和共濟失調(diào)等疾病有關(guān)[5]。然而，目前對鈣離子通道的認識并不完善，近年來雖然有一些鈣離子通道阻滯劑進入臨床研究，如CNV-2197944、Z160 等，但進展緩慢，且開發(fā)收效甚微[6]。為改善鈣離子通道類藥物的研發(fā)現(xiàn)狀，需要對鈣離子通道及其作用機制更深入研究，以便開發(fā)出更高效、更安全的鈣離子通道阻滯劑，更好地造福人類。

1 電壓門控鈣離子通道

1.1 電壓門控鈣離子通道亞基的結(jié)構(gòu)和功能

VGCC 中的10 種α1 亞基的4 個主要跨膜區(qū)具有相同的跨膜結(jié)構(gòu)，每個跨膜結(jié)構(gòu)有6 個跨膜螺旋（S1、S2、S3、S4、S5 和S6），S1、S2、S3 和S4部分形成了電壓敏感域（VSD），帶正電荷的S4 部分控制電壓依賴的激活，S5 和S6 之間有一個P-loop形成可透過的通路，含有高度保守的帶負電荷的氨基酸殘基（高壓激活型鈣離子通道中為谷氨酸）協(xié)同形成孔道，對鈣、鋇、鍶等陽離子具有很高的選擇性，并且能與非透過的二價陽離子（如鎘離子）相互作用。每個跨膜結(jié)構(gòu)包含一個電壓傳感器基序，在膜去極化時響應使通道打開[7-8]。氨基末端、羧基末端以及4 個跨膜結(jié)構(gòu)之間的鏈接物面向細胞質(zhì)，是第二信使調(diào)控通道功能的重要靶點[9]。高壓激活型鈣離子通道的α1 亞基與輔助亞基共同裝配后，獲得完整的通道功能[4]。

CaVβ 亞 基 有4 個 已 知 編 碼 基 因（CaVβ1、CaVβ2、CaVβ3、CaVβ4），同時有多個選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本。CaVβ 是胞質(zhì)蛋白，與CaVα1 亞基的Ⅰ-Ⅱlinker結(jié)構(gòu)域連接。CaVβ 亞基能夠改變CaVα1 的門控特性，對增加細胞表面運輸可能起重要作用[10]。CaVα2δ亞 基 有4 種 不 同 的 類 型（CaVα2δ1、CaVα2δ2、CaVα2δ3、CaVα2δ4），作為單獨的蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯，然后裂解成CaVα2和CaVδ，再通過二硫鍵重新連接[11]。CaVα2 完全暴露在細胞外環(huán)境中，CaVδ 的作用相當于一個膜錨，通過一個磷脂酰肌醇錨定在質(zhì)膜外，CaVα2δ 的共表達能夠控制α1 亞基的運輸、定位和生物物理特性，并且能夠促進加巴噴丁類藥物（普瑞巴林和加巴噴?。┑慕Y(jié)合，抑制神經(jīng)病理性疼痛[12]。骨骼肌特異型L-型通道有輔助亞基CaVγ，它有4 個跨膜螺旋，與α1 亞基跨膜螺旋Ⅳ的VSD 區(qū)域結(jié)合。在神經(jīng)組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少于7 個潛在的CaVγ 亞型[13]，但關(guān)于其功能了解很少（見圖1）。

圖1 電壓門控鈣離子通道亞基結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Subunit structure of voltage-gated calcium channels

1.2 電壓門控鈣離子通道的分類和亞型

VGCC 按照電壓激活特性分類，可分為高電壓激活型（high voltage activation，HVA）和低電壓激活型（low voltage activation，LVA），HVA 通道在膜去極化程度大時響應激活，而LVA 通道在低電壓變化時即可激活，此時的膜電位與神經(jīng)元靜息膜電位相近[14]；按照鈣離子電流門控特性分類，可分為L-型、P/Q-型、N-型、R-型和T-型；按照α1 亞基的基因型，可分為CaV1、CaV2、CaV3 這3 個家族，每個家族又包含多個成員[15-18]（見表1）。

CaVα1 是形成鈣離子通道亞型的決定因素。CaV1 通道家族編碼3 個不同的L-型通道（CaV1.2、CaV1.3 和CaV1.4）以及一個骨骼肌特異型CaV1.1，表現(xiàn)為激發(fā)和持續(xù)的電流時間較長，對二氫吡啶（DHP）拮抗劑和激動劑很敏感。CaV2 通道家族包括3 個成員（CaV2.1、CaV2.2 和CaV2.3）。通過選擇性剪接和裝配特定的輔助亞基，CaV2.1 產(chǎn)生了P-型和Q-型通道，它們均能被ω-agatoxin IVA（從美洲漏斗網(wǎng)蜘蛛毒液中分離的肽）阻斷。CaV2.2 編碼的N-型通道能夠被海洋捕魚軟體動物地紋芋螺Conus geographus和其毒液中分離的ω-芋螺毒素GVIA 和MVIIA 抑制。CaV2.3 對應R-型通道，能被一種從Hyristocrates GigasTarantula 的毒液中分離的多肽SNX-482 抑制[19]。CaV3 通道有3 種類型（CaV3.1、CaV3.2 和CaV3.3），全部屬于T-型鈣離子通道，通過對被鎳離子和鈣離子阻斷的相對電阻敏感性可以區(qū)分CaV3 通道不同類型[20]。

表1 電壓門控型鈣離子通道的藥理和生理特征[15-18]Table 1 Pharmacological and physiological characteristics of voltage-gated calcium channels

2 電壓門控鈣離子通道上市藥物及其作用機制

2.1 L-型電壓門控鈣離子通道藥物

L-型 鈣 離 子 通 道（L-type calcium channels，LTCC）是臨床上鈣離子通道阻滯劑的重要作用靶點，在10 個已知的α1 亞基中，有4 個屬于LTCC（CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4），含有二氫吡啶類和其他有機鈣離子通道阻滯劑類藥物的高親和力結(jié)合位點，但在組織表達和門控特性方面存在差異。CaV1.1 通道幾乎只存在于骨骼肌中，CaV1.4 通道主要局限于視網(wǎng)膜中，而CaV1.2 和CaV1.3 在多種組織中有表達，甚至同時存在于同一細胞中[21]。這些通道的異常與一些疾病的發(fā)生有關(guān)，如精神疾病或心律失常[22]。目前針對LTCC 的藥物有二氫吡啶類的伊拉地平（isradipine）、硝苯地平（nifedipine），苯烷胺類的維拉帕米（verapamil）以及苯二氮?類的地爾硫?（diltiazem）。雖然上述藥物的結(jié)構(gòu)不同，但它們均結(jié)合在靠近孔道和α1 亞基激活門的一段單獨重復的藥物結(jié)合區(qū)域，并與這個結(jié)合區(qū)域進行立體選擇性地可逆結(jié)合[23-24]。

2.1.1 二氫吡啶類二氫吡啶類是一類具有廣泛生物和藥理作用的藥物，在心血管疾病的治療中廣泛應用，具有抗高血壓、抗心絞痛、擴張血管和抑制心臟等作用，1，4-二氫吡啶環(huán)為其基本支架[25]。不帶電的二氫吡啶類藥物主要穩(wěn)定和誘導失活的通道狀態(tài)，它們對失活的LTCC 構(gòu)象具有很高的親和力，因此在去極化電壓較大時，二氫吡啶類藥物阻斷心血管LTCC 的半抑制濃度（IC50）很低。二氫吡啶類藥物對失活LTCC 的優(yōu)先親和性，正解釋了其能夠在治療劑量下發(fā)揮強大的血管舒張作用的同時，不影響心臟收縮力的特性[26]。

伊拉地平（1）是美國食品和藥品管理局（FDA）批準的一種二氫吡啶鈣離子通道阻滯劑，可選擇性地與大腦海馬區(qū)CaV1.2 結(jié)合，通過抑制鈣離子流入細胞質(zhì)和抑制CaV1.2 的表達來減少β 淀粉樣低聚物的毒性，因此可用于治療阿爾茨海默病。伊拉地平對CaV1.3 也具有很高的親和力，是一種潛在可行的帕金森病的神經(jīng)保護劑[27]，此外，它對高血壓也有很好的治療作用[28]。硝苯地平（2）能夠抑制CaV1.2 通道，阻止鈣離子進入細胞內(nèi)[25]，使血管平滑肌得到放松，且作用濃度明顯低于對心臟產(chǎn)生顯著直接影響時的濃度，可用于治療心絞痛和高血壓[29]。

2.1.2 苯烷胺類和苯二氮?類苯烷胺類和苯并噻吩類能夠與開放和失活狀態(tài)的通道高親和力結(jié)合。在生理狀態(tài)的pH 條件下，苯烷胺類和苯二氮?類主要以帶正電荷的有機陽離子的形式存在，在通道開放時遞送至胞質(zhì)側(cè)的結(jié)合位點[30-31]；它們能穩(wěn)定通道的失活狀態(tài)，減緩了通道從失活狀態(tài)中恢復的速度，從而導致頻率依賴性的抑制，其主要作用是抗心律失常[32]。

維拉帕米（3）于1962 年由德國Knoll 公司研制成功，商品名為Isoptin，又稱為異搏定、異博停、戊脈安，是首個臨床上使用的苯烷胺類的抗心律失常、抗心絞痛、抗高血壓的藥物。維拉帕米屬于季苯烷胺類藥物，有研究表明，它以不帶電的形式穿過細胞膜，進入胞液后，以質(zhì)子化的形式進入細胞內(nèi)的孔道（α1）中并與受體位點結(jié)合，從而阻斷CaV1.2[33]。

地爾硫?（4）屬于苯二硫氮雜?類鈣拮抗劑，通常以鹽酸鹽的形式存在，目前已有100 多個國家在臨床上用作抗心絞痛藥、降壓藥。地爾硫?能與CaV1.2 的IIIS6 和IVS6 片段結(jié)合，阻斷鈣離子進入細胞，擴張冠狀動脈，同時增加冠狀動脈血流量，從而使血壓和心率降低。與其他藥物相比，地爾硫?在降壓時沒有反射性心律加快的不良反應，不增加心肌耗氧量從而保護心臟，在臨床使用上更加安全有效[34-35]。

2.2 N-型電壓門控鈣離子通道藥物

N-型（CaV2.2）VGCC 主要表達在神經(jīng)末梢，控制著神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和釋放，能夠傳導電流，調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，在傳遞疼痛信號方面發(fā)揮重要作用。N-型VGCC 的抑制劑或調(diào)節(jié)劑是治療神經(jīng)性疼痛的有效藥物[36]。

加巴噴?。╣abapentin，5）最初于1993 年在英國獲得批準，曾被認為是一種抗癲癇藥物，現(xiàn)在也被用作治療神經(jīng)性疼痛的一線藥物，特別是糖尿病神經(jīng)痛和皰疹后神經(jīng)痛。加巴噴丁能夠與VGCC的輔助亞基α2δ1 特異性結(jié)合，抑制了在背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）神經(jīng)元的突觸前末端和背角神經(jīng)元中，因神經(jīng)損傷導致的鈣離子通道α1 孔道形成單元由細胞質(zhì)向質(zhì)膜的運輸，也抑制了α2δ1 從DRG 到背角神經(jīng)元的軸向順行運輸[37-38]。普瑞巴林（pregabalin，6）是第2 代靶向α2δ1 的藥物，于2004年在歐洲被批準用于外周神經(jīng)性疼痛的控制，并作為局部癲癇的輔助治療[39]。普瑞巴林可能是通過下調(diào)脊髓瞬時陽離子通道亞家V 成員1 蛋白受體（the transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1）的表達來緩解神經(jīng)病理性疼痛[40]，是治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛的一線藥物。

齊考諾肽（ziconotide，商品名Prialt，見圖2）于2004 年在FDA 和歐盟獲得批準，是人工合成的ω-芋螺毒素MVIIA，能與CaV2.2 通道的特異性可逆結(jié)合，通過阻斷脊髓背角傳入神經(jīng)釋放前痛覺神經(jīng)遞質(zhì)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[41]，目前用于治療阿片藥物治療無效的慢性疼痛。齊考諾肽是由25 個氨基酸組成的多肽，給藥方式為鞘內(nèi)注射。與阿片類藥物嗎啡相比，使用齊考諾肽不會產(chǎn)生急性戒斷癥狀，也沒有任何已知的上癮風險，長時間服用也不易產(chǎn)生耐受[42-43]。如果需要停止使用齊考諾肽也可以立即停止，無需減少劑量[44]。齊考諾肽的這些優(yōu)點，使其成為治療慢性疼痛，尤其是對嗎啡耐受疼痛的重要藥物，也為開發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供了思路。

圖2 齊考諾肽的球棍模型結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Ball-and-stick model of ziconotide

2.3 R-型電壓門控鈣離子通道藥物

R-型VGCC 屬于鈣離子通道CaV2.3 亞型，它的作用至今尚未明確。SNX-482 是一種選擇性的、電壓依賴的CaV2.3 通道抑制劑，它能與CaV2.3 的結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ相互作用，有效阻滯R-型VGCC，加大劑量后也可以阻滯L-型和P/Q-型VGCC 和鈉離子通道[45]。

3.4 T-型電壓門控鈣離子通道藥物

T-型VGCC 為鈣離子通道CaV3.2 亞型，是傳入性疼痛通路中疼痛信號的重要調(diào)控因子，在不同的慢性疼痛狀態(tài)下，鈣離子通道的活性受到不同程度的調(diào)控。因此，抑制DRG 神經(jīng)元和脊髓背角的T-型VGCC 可以作為鎮(zhèn)痛的靶點。T-型VGCC 在膜去極化程度較小時打開，允許鈣離子進入細胞，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，促進脊髓背角中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。參與疼痛信號傳導的主要CaV3 通道亞型是CaV3.2[46]。

乙琥胺（ethosuximide，7）是T- 型VGCC 阻滯劑，臨床上用于治療失神性癲癇。乙琥胺也可以逆轉(zhuǎn)動物模型中的疼痛，但還沒有在人體中得到有效性的報道[47]。咪拉地爾（mibefradil，8）也是T-型VGCC 阻滯劑，且對CaV3.2 的阻斷強于CaV3.1和CaV3.3，可使神經(jīng)損傷引起的疼痛和神經(jīng)興奮恢復正常，在臨床上已被用于治療慢性心絞痛和高血壓[48]，但是由于嚴重的藥物相互作用，咪拉地爾上市一年后被撤市，10 年后被FDA 批準為孤兒藥，用于研究其對腦癌、卵巢癌和胰腺癌的療效[49]。目前最有前景的T-型VGCC 阻滯劑是Z944（9）和ACT-709478（10），已經(jīng)進入臨床試驗階段[50]。

2.5 P/Q-型電壓門控鈣離子通道藥物

P/Q- 型VGCC 由基因CACNA1A編碼，選擇性剪接來自α1 亞基基因的信使mRNA 產(chǎn)生了P-型和Q-型電流（分別稱為CaV2.1a 和CaV2.1b），這些變異體可以通過對蜘蛛毒素ω-agatoxin IVA 的敏感性進行區(qū)分[51]。與P-型VGCC 相比，Q-型VGCC 失活慢，這是因為CaV2.1b 的Ⅰ-Ⅱlinker 結(jié)構(gòu)域上插入了一個氨基酸（纈氨酸）。CaV2.1 是大腦中最豐富的α1 亞基，在大鼠和人類的腎臟中也有表達[52]。

蜘蛛毒素ω-agatoxin IVA 是一種選擇性抑制P/Q-型VGCC 的多肽，它能夠在低于10 nmol · L-1的濃度下阻滯P-型VGCC，而在較高的濃度下阻滯Q-型VGCC，但是由于它的相對分子質(zhì)量較大，不適合作為臨床藥物使用[53]。

3 結(jié)語

VGCC 不僅能夠改變細胞電位，還能進行信號轉(zhuǎn)導，這賦予了VGCC 更加廣泛的功能。近年來，隨著實驗技術(shù)的提高和研究手段的改進，VGCC 的結(jié)構(gòu)得到了進一步解析，這促進了VGCC 阻滯劑的發(fā)現(xiàn)及進入臨床應用。L-型VGCC 在抗高血壓、抗心律失常和抗心絞痛方面發(fā)揮重要作用，L-型VGCC阻滯劑如二氫吡啶類的硝苯地平、伊拉地平，苯烷胺類的維拉帕米，苯二硫氮雜?類的地爾硫?等，均在臨床上得到了廣泛的應用[27,29,33-35]。N-型和T-型VGCC 阻滯劑與鎮(zhèn)痛關(guān)系密切，如加巴噴丁和普瑞巴林[12]；近年來對動物毒素的研究越來越多，動物毒性肽如齊考諾肽的上市為開發(fā)此類藥物提供了新的思路[41-44]；此外，甚至發(fā)現(xiàn)了T-型VGCC 的抗癌作用[54]。R-型和P/Q-型VGCC 的研究較少，對其功能的了解尚不完善，目前也沒有相關(guān)藥物上市。本文對上述VGCC 的結(jié)構(gòu)、作用靶點和上市藥物進行了概述（見表2），期望為其后續(xù)研發(fā)提供參考。

筆者所在課題組從齊考諾肽的發(fā)現(xiàn)和應用中受到啟發(fā)，選擇了少棘蜈蚣（Scoropendra subspinipes mutilans）這一傳統(tǒng)中藥材，通過構(gòu)建cDNA 文庫，使用高通量測序技術(shù)測序后，在得到的蛋白質(zhì)序列中篩選具有鎮(zhèn)痛活性的多肽并進行活性研究，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有一定活性的多肽片段。目前正在對這些多肽片段進行進一步的活性評價，期待它們能表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛效果。

表2 電壓門控型鈣離子通道藥物的靶點和適應證Table 2 Targets and indications of voltage-gated calcium ion channel drugs