參與P-gp 膜定位和功能調(diào)控的相關(guān)蛋白研究進展

吳桐，劉曉東

（中國藥科大學藥學院藥物代謝研究中心，江蘇 南京 210009）

ATP 結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運體是一種包含多種跨膜轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運蛋白家族合稱，在包括磷脂、固醇、膽汁酸、肽類及各種藥物在內(nèi)的多種底物跨膜運輸中起到重要作用。這些轉(zhuǎn)運體通過和ATP 結(jié)合后水解產(chǎn)生的能量，將特異性底物逆濃度梯度泵送到細胞外側(cè)。在人類中共鑒定出49 種ABC 轉(zhuǎn)運蛋白，并將其分為7 組（ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG）。P-gp（P-glycoprotein）作為ABC家族的成員之一，最早發(fā)現(xiàn)主要表達于多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）細胞中；近來發(fā)現(xiàn)在腸上皮細胞、肝臟、腎小管上皮細胞和腦血管內(nèi)皮細胞中均有表達。P-gp 主要功能是通過介導外源化合物的外排轉(zhuǎn)運來保護這些器官，但同時也阻礙腸道內(nèi)藥物吸收及藥物向腦內(nèi)分布。P-gp 被認為是參與包括胰腺癌和白血病在內(nèi)的多種癌細胞MDR 現(xiàn)象的重要轉(zhuǎn)運體[1-2]。

針對P-gp 在疾病發(fā)生和治療過程中的重要作用以及P-gp 功能和表達的調(diào)控因素已有廣泛研究。其中包括維拉帕米（verapami）、環(huán)孢素A（cyclosporin A）、長春新堿（vincristine）等在內(nèi)的P-gp 抑制劑，通過改變ATP 水解酶活性、競爭性占據(jù)結(jié)合位點等方式抑制P-gp 的功能，但也存在著和其他藥物相互作用誘導毒性的風險[3]。先前筆者所在課題組的研究結(jié)果證實，在大鼠肝性腦病疾病模型中，體內(nèi)膽紅素和血氨等特異性物質(zhì)升高引發(fā)的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，將會激活包括核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）和細胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2）等信號通路，對P-gp 的功能和表達起調(diào)控作用[4-5]。糖尿病狀態(tài)下肝臟內(nèi)P-gp 表達會升高，腸道內(nèi)的P-gp 表達將會下降[6]。P-gp 主要在細胞膜上發(fā)揮功能，mRNA 水平翻譯之后，通過ERM（ezrin/radixin/moesin）蛋白家族錨定在膜上，其中脂筏（lipid raft）區(qū)域在P-gp 轉(zhuǎn)運通道的形成中起重要作用，微囊蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）定位于小窩（caveolae），作為脂筏上一種重要蛋白成分，與P-gp 結(jié)合調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)和功能（見圖1）。本文將圍繞P-gp 在膜上的定位與轉(zhuǎn)運過程，闡釋相關(guān)蛋白對于P-gp 膜上的功能和表達的調(diào)控作用。

圖1 ERM 及caveolin-1 對P-gp 在膜上的定位和功能調(diào)控機制Figure 1 Regulation of ERM and caveolin-1 on P-gp location and function on cell membrane

1 P-gp 轉(zhuǎn)運體

P-gp 最早在中國倉鼠卵巢細胞中發(fā)現(xiàn)，因其具有阻止細胞毒性藥物進入細胞的功能，將其命名為通透性糖蛋白（permeability glycoprotein，P-gp）。P-gp是一個相對分子質(zhì)量為170 000 的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白，由1 280 個氨基酸組成，是一種由人類MDR1基因編碼的能量依賴性藥物外排轉(zhuǎn)運體。人P-gp 由2 個對稱的氨基N-末端和羧基C-末端盒式結(jié)構(gòu)組成，具有43%的相似性，并且每個盒式結(jié)構(gòu)均包括6 個跨膜段，其上帶有ATP 結(jié)合基團。P-gp 先與ATP結(jié)合再水解，通過這一過程釋放能量，來達到轉(zhuǎn)運的目的[7-9]。

P-gp 高表達通常見于一些富集轉(zhuǎn)運體的組織處引發(fā)的腫瘤，例如胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎上腺癌和腎癌[1,10]，通常在卵巢、乳腺和食道及胃的腫瘤中觀察到低水平的P-gp 表達[11-12]，然而在例如肺癌和淋巴瘤的化療過程中會升高P-gp 的表達水平，從而導致MDR 發(fā)展[13-14]。在正常組織中，P-gp 也有表達，并且發(fā)揮著特殊的生理作用。在肝臟中，P-gp表達在肝細胞膽管側(cè)膜，在腎臟中P-gp 主要位于近曲小管的上皮細胞的腔側(cè)面。由于P-gp 在肝臟和腎臟的特殊位置，促進藥物從肝細胞側(cè)排向膽管或從腎小管上皮細胞外排至尿液，參與藥物膽汁排泄和腎清除過程[15]。結(jié)腸和空腸的上皮細胞腔側(cè)面表達有P-gp，具有限制口服藥物吸收進入血液的作用，這成為口服藥物生物利用度低的重要原因之一[16]。P-gp 也高表達于腦微血管內(nèi)皮細胞的腔側(cè)膜上，其功能是防止毒素和藥物進入腦內(nèi)，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“守門人”[17-18]。

2 ERM 蛋白對P-gp 的作用

2.1 ERM 蛋白家族

ERM 蛋白家族由埃茲（ezrin，Ezr）蛋白、根（radixin，Rdx）蛋白和膜突（moesin，Msn）蛋白3 種相似蛋白組成，集中于富含肌動蛋白的細胞表面，在細胞骨架和細胞膜之間起連接作用。ERM 由包含300 個氨基酸殘基的FERM（erythrocyte band four point one Ezrin-Radixin-Moesin）結(jié)構(gòu)域和約200 個氨基酸殘基組成的中段α-螺旋區(qū)域及100 個氨基酸殘基構(gòu)成的C-末端構(gòu)成。在細胞膜結(jié)構(gòu)中，ERM 氨基端FERM 和C-末端分別與質(zhì)膜和肌球蛋白位點結(jié)合，在細胞的黏附、形態(tài)構(gòu)建和質(zhì)膜功能蛋白質(zhì)的定位過程中發(fā)揮重要作用[19-20]。

2.2 ERM 蛋白對P-gp 膜定位和轉(zhuǎn)導的調(diào)控作用

通常用P-gp 的mRNA 水平作為判斷其活性的指標，但一些研究顯示P-gp 的mRNA 水平并不總與其活性水平相關(guān)[19,21-22]。如小腸中P-gp 的mRNA水平，從十二指腸到回腸段呈現(xiàn)增加的趨勢。文獻報道顯示，P-gp 的底物維拉帕米在十二指腸、空腸和回腸段均被吸收，最大外排出現(xiàn)在空腸段[21]。在回腸的上端至中段區(qū)域內(nèi)mRNA 水平呈降低趨勢，但在末端達到最高[22]，而P-gp 底物羅丹明123（rhodamine 123，Rho 123）在回腸中段觀察到最大外排[19]。

只有定位在細胞質(zhì)膜（plasma membrane）上P-gp才能顯示其外排活性。作為質(zhì)膜蛋白的連接蛋白，ERM 家族在其調(diào)控過程中扮演了重要的角色。有研究顯示，在小鼠小腸內(nèi)P-gp 的mRNA 和蛋白水平從頂端至底部呈現(xiàn)升高的趨勢，Rdx 蛋白也呈現(xiàn)相同的趨勢。同野生型小鼠相比，Rdx基因敲除小鼠在小腸中下部質(zhì)膜上P-gp 的表達顯著降低，進而影響外排Rho123 作用，其P-gp 的mRNA 水平未見明顯改變[23]。在人結(jié)腸腺癌細胞 (Caco-2)模型中，沉默Rdx也顯著降低細胞膜上P-gp 的表達，但對細胞膜的功能未造成影響。沉默Ezr和Msn并沒有影響到細胞膜上P-gp 的表達[24-25]，上述結(jié)果提示在小腸上主要由Rdx 參與細胞膜上P-gp 的定位調(diào)節(jié)。

在人體外血腦屏障模型細胞系（hCMEC/D3）中，沉默Rdx也能顯著降低P-gp 在膜上的表達；而抑制Msn可降低P-gp 的外排活性，但并沒有影響到P-gp 在膜上的分布。沉默Ezr對于P-gp 在膜上的表達和功能均未產(chǎn)生影響，證實在hCMEC/D3 細胞中Ezr 對于P-gp 無調(diào)控作用[26-27]。另有文獻報道，在嗎啡誘導5 d 后小鼠原代腦血管細胞中，Msn 和P-gp 膜蛋白表達均顯著升高，其總蛋白水平不變。免疫熒光沉淀也證實Msn 和P-gp 的膜共定位[28]。上述研究結(jié)果也證實，在血腦屏障上的P-gp 膜定位受到Rdx 和Msn 的影響，結(jié)構(gòu)上與Msn 存在相關(guān)性，Ezr 未對P-gp 產(chǎn)生調(diào)控行為。肝臟炎癥的大鼠上也發(fā)現(xiàn)P-gp 表達隨著Rdx 水平的降低而降低[29]。同時有研究證明，在人肝癌細胞系（HepG-2）中，沉默Rdx也導致細胞膜上P-gp 表達減少，總蛋白水平不變，沉默Msn未見類似的改變，而沉默Ezr降低了P-gp 的mRNA 水平。說明在肝細胞膜P-gp 的定位同樣和Rdx 有關(guān)聯(lián)，Ezr 在翻譯水平上影響了P-gp的表達[30]。腎臟中尚未見P-gp 膜上定位的改變同ERM 蛋白家族調(diào)節(jié)有關(guān)的報道。

上述結(jié)果部分驗證了ERM 蛋白家族在P-gp 膜定位中作用。P-gp 在翻譯后被糖基化，隨后被運送至質(zhì)膜并插入質(zhì)膜，在質(zhì)膜中活化的ERM 蛋白與P-gp 連接以穩(wěn)定其膜定位。因此，ERM 家族蛋白的表達調(diào)節(jié)將直接影響P-gp 在質(zhì)膜上的定位，進而影響P-gp 活性。

3 Caveolin-1 蛋白對P-gp 的作用

3.1 脂筏與caveolin-1 蛋白

細胞膜是由膽固醇、磷脂、糖脂和蛋白質(zhì)構(gòu)成的磷脂雙分子結(jié)構(gòu)，其中蛋白以覆蓋、貫穿、嵌入3 種方式和膜連接。脂筏是細胞膜上由鞘脂和膽固醇組成的特殊脂質(zhì)微區(qū)，因為鞘脂包含更長和更多的飽和脂質(zhì)尾巴，所以鞘脂/膽固醇脂質(zhì)筏要比周圍甘油磷脂組成的膜環(huán)境更厚且流動性更差。迄今為止，各種對于脂筏結(jié)構(gòu)的研究將脂筏的結(jié)構(gòu)定義為一種小窩結(jié)構(gòu)，即在細胞膜上呈現(xiàn)燒瓶狀內(nèi)陷，并且被Cav-1 包被[31]。

Cav-1 是小窩主要的膜內(nèi)在蛋白，其相對分子質(zhì)量為22 000，其特征是具有異常的發(fā)夾狀構(gòu)象，其中N 端和C 端區(qū)域均面向細胞質(zhì)[32]。Cav-1 和許多蛋白質(zhì)相互作用。在腦部Cav-1 可以通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶對緊密連接蛋白的分解作用來保護血腦屏障的完整性[33]。在肝臟中，Cav-1 作為一種調(diào)控蛋白，參與到肝臟的脂質(zhì)蓄積、葡萄糖代謝和肝細胞生殖等多種生理活動中[34]。Cav-1 還參與到多種調(diào)節(jié)細胞功能的信號通路環(huán)節(jié)中。如Cav-1 的下調(diào)可激活ERK 信號通路，從而減少了細胞的遷移[35]。

3.2 脂筏上caveolin-1 對P-gp 的調(diào)控

P-gp 屬于跨膜蛋白，對于所處細胞膜周圍的脂質(zhì)環(huán)境非常敏感，P-gp 和脂筏區(qū)域有著密切的聯(lián)系。P-gp 在脂筏區(qū)域的表達與細胞系種類和細胞裂解技術(shù)有關(guān)，并和Cav-1 的表達存在一定的相關(guān)性。如在人結(jié)腸癌高表達多藥耐藥蛋白細胞系（HT-29-MDR）和人乳腺癌細胞系（MCF-7/AdrR）中，P-gp在脂筏區(qū)域的表達高達38% ～ 40%[36]。在過表達P-gp的AuxB1 細胞和耐藥細胞CHRC5 中觀察到P-gp 和Cav-1 共定位。在腦腫瘤組織中同樣觀察到P-gp 位于富含Cav-1 的微囊結(jié)構(gòu)中，P-gp 和Cav-1 共同表達于管腔內(nèi)皮間室[37]。Cav-1 與P-gp 蛋白共膜定位，Cav-1 與P-gp 相互作用形成了高分子復合物，以此調(diào)控P-gp 活性。當小窩結(jié)構(gòu)被抑霉菌素破壞，P-gp的轉(zhuǎn)運活性也受到了影響[38]。這些研究表明P-gp在脂筏區(qū)域高度表達，小窩可能是P-gp 發(fā)揮外排轉(zhuǎn)運功能的主要區(qū)域，其活性也受到該區(qū)域的膽固醇和糖脂等多方面因素影響。

目前對于Cav-1 與P-gp 的研究主要集中在腦組織及相關(guān)體外模型。在大鼠腦內(nèi)皮細胞系RBE4 中，小干擾RNA（siRNA）下調(diào)Cav-1 的表達后，P-gp底物紫杉醇和長春新堿在RBE4 中的累積分別降低了約38%和40%，這一過程通過降低Cav-1 表達減弱了與P-gp 的相互作用，進而增加P-gp 的轉(zhuǎn)運活性。用酪氨酸激酶處理使得Cav-1 磷酸化后，紫杉醇和長春新堿的累積分別增加了27%和30%。提示Cav-1 的磷酸化增強Cav-1 和P-gp 之間的相互作用，從而抑制了P-gp 的轉(zhuǎn)運功能[39]。另一項研究使用H2O2處理人體外血腦屏障模型hCMEC/D3，在20 min 內(nèi)顯著降低P-gp 外排轉(zhuǎn)運活性，并降低了其在膜上的表達，但總蛋白含量并沒有受到影響，這說明P-gp 在膜上的功能和表達受到細胞內(nèi)部翻譯后的調(diào)控，氧化應(yīng)激同樣增加了Cav-1 的磷酸化，增強了Cav-1 同P-gp 之間的作用，導致P-gp 外排活性降低，去除氧化應(yīng)激后，P-gp 的活性恢復[40]。

關(guān)于Cav-1 與P-gp 之間的關(guān)聯(lián)在1998 年就被報道[41]。Cav-1 的過表達可誘導細胞膜上膽固醇水平的降低，抑制P-gp 的活性[42]。在人乳腺癌細胞MCF-7/ADR 中，Rack1 受體通過調(diào)節(jié)Cav-1 磷酸化在不改變P-gp 蛋白水平的條件下調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)運活性[43]。Abl 和Scr 等酪氨酸激酶能夠引發(fā)Cav-1 的磷酸化，進而增強Cav-1 與P-gp 相互作用，抑制P-gp 外排活性，而下調(diào)Cav-1 表達則會增強P-gp 外排活性，說明Cav-1 對于P-gp 功能呈現(xiàn)負性調(diào)節(jié)作用。Dynamin 家族是一類鳥苷酸三磷酸酶（guanylate triphosphatase），是細胞在進行內(nèi)呑（endocytosis）過程中的一種特異性蛋白，它參與囊泡從細胞膜上出芽和剪切的過程。有報道指出，磷酸化的Cav-1與dynamin 蛋白協(xié)同作用，可引導細胞微囊表面的內(nèi)吞作用，與P-gp 形成的復合物因內(nèi)吞作用被內(nèi)化，導致了P-gp 的外排效果降低[44]。

4 結(jié)語

P-gp 部分定位在脂筏區(qū)域，其功能的調(diào)節(jié)與脂筏區(qū)域的脂質(zhì)和蛋白環(huán)境有著密切關(guān)系。質(zhì)膜上的膽固醇和鞘脂對P-gp 功能的發(fā)揮也起到一定影響[45-46]，脂筏作為質(zhì)膜上脂質(zhì)分子富集的區(qū)域，形成了有利于P-gp 信號轉(zhuǎn)導和定位的細胞環(huán)境。在星形膠質(zhì)細胞等細胞中均發(fā)現(xiàn)了關(guān)于P-gp 在小窩環(huán)境中的免疫標記，并與Cav-1 共定位，在耐去污劑的細胞膜結(jié)構(gòu)中也證實了P-gp 同細胞骨架之間的聯(lián)系[47]。此外，有研究報道，通過免疫沉淀證實ERM 蛋白家族與P-gp 共定位，并且作為連接P-gp 同肌動蛋白和細胞膜結(jié)構(gòu)的支架蛋白一起存在于脂筏區(qū)[48]。ERM 蛋白的表達改變及磷酸化會影響P-gp 在膜上的表達，進而對跨膜運輸作用產(chǎn)生直接影響，作為骨架蛋白，ERM 參與了P-gp 翻譯后在質(zhì)膜上的表達過程。Cav-1 蛋白作為構(gòu)成脂筏區(qū)的主要調(diào)控蛋白，通過小窩蛋白結(jié)合基序在P-gp 的36 ～ 44 位氨基酸與P-gp 相互作用，導致P-gp 外排活性降低，對P-gp 的跨膜運輸活性起到負向調(diào)節(jié)作用，磷酸化的Cav-1 會進一步加強這種作用。通過對ERM 和Cav-1 的研究，對于從質(zhì)膜內(nèi)的蛋白角度闡釋P-gp在膜上功能和表達改變的機制提供了新的思路，對疾病狀態(tài)下P-gp 的特異性改變提供了研究方向，對MDR 等現(xiàn)象開發(fā)抑制性藥物提供了新的靶點。