姜黃素通過miR-146a抑制NF-κB信號(hào)通路保護(hù)大鼠糖尿病腎病的機(jī)制研究

陳 靜，王 茜，王 凱，李文建，李易明*

(1.河北省黃驊市骨科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 黃驊 061100；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050000；3.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院普外科，上海 200061；4.河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，河北 石家莊 050017)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)作為一種內(nèi)分泌疾病，是糖尿病中最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。當(dāng)前全球大約有2/5的糖尿病患者會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的DN并發(fā)癥[1]。在疾病末期，DN患者出現(xiàn)腎衰竭，最終導(dǎo)致死亡[2]。DN病理損傷過程中，腎小球及腎小管發(fā)生增生、肥大，炎性細(xì)胞浸潤以及腎小球系膜細(xì)胞損傷等病理性改變，導(dǎo)致尿液中出現(xiàn)蛋白、尿液減少等臨床癥狀。近年來研究者提出“微炎癥”學(xué)說，認(rèn)為DN是由炎癥引起的代謝紊亂性疾病，高炎癥被認(rèn)為是DN的顯著特點(diǎn)[3]。在高糖微環(huán)境中，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號(hào)通話的激活被認(rèn)為在促炎環(huán)境中起到至關(guān)重要的作用。MicroRNAs(miRNAs)作為一種非編碼短鏈微小RNA，對(duì)靶基因表達(dá)具有調(diào)控作用。MicroRNAs在腎臟疾病中起到何種作用，是一個(gè)備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。在DN發(fā)展過程中，MicroRNAs調(diào)節(jié)炎癥的作用機(jī)制尚不清楚。姜黃素具有抗炎[4]、抗氧化[5]和降血糖[6]等作用。本研究課題通過構(gòu)建大鼠DN動(dòng)物模型，觀察姜黃素對(duì)miR-146a mRNA表達(dá)的影響，探討姜黃素在DN中緩解腎臟損傷的機(jī)制研究，為臨床治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料來源 體重220 g左右的雄性SD大鼠(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買，合格證編號(hào)：1808247)；鏈脲佐菌素、姜黃素(美國 Sigma公司)；尿蛋白測定試劑盒(上海生工生物有限公司)；Nephrin兔抗鼠單抗、NF-κB p65兔抗鼠單抗(美國Abcam公司)；Trizol RNA抽提試劑、Real-time ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaTM熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(廣州銳博技術(shù)有限公司)；Western blot制膠試劑盒(碧云天生物公司)；全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼公司)； Nanodrop ND-2000(美國Thermo公司)；7500 Fast型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國ABI公司)；萊卡正置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；蛋白印跡試驗(yàn)裝置(美國Bio-Rad公司)。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由廣州銳博技術(shù)有限公司合成。將SD大鼠分為：空白對(duì)照組(N組)：無需任何處理；糖尿病腎病模型組(DN組)：僅建立DN動(dòng)物模型；姜黃素干預(yù)治療組(CT組)：在建立DN動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，每天姜黃素懸液灌胃(500 mg/kg)，干預(yù)治療持續(xù)4周。N組和DN組每天用PBS進(jìn)行灌胃干預(yù)治療，持續(xù)4周。

1.2方法

1.2.1大鼠DN模型的制備[7]給予SD大鼠高脂、高糖飼料喂養(yǎng)。連續(xù)高脂、高糖喂養(yǎng)6周后，每只SD大鼠按照30 mg/kg 腹腔注射1% 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)，腹腔連續(xù)注射1周。繼續(xù)給予高脂、高糖飼料喂養(yǎng)4周，利用代謝籠收集24 h大鼠尿液。滿足以下條件：①24 h尿蛋白≥0.4 mg；②隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，才能確認(rèn)DN大鼠動(dòng)物模型建模成功。

1.2.2大鼠生化指標(biāo)檢測 利用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，室溫條件下靜置10 min，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，隨后按照試劑盒說明書進(jìn)行上機(jī)操作，檢測尿蛋白。用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開腹后從腹主動(dòng)脈獲取血清，利用全自動(dòng)生化分析儀測定血糖(blood glucose，BG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)和尿白蛋白肌酐比值(urine albumin creatine ratio，UACR)等生化指標(biāo)。

1.2.3腎組織病理學(xué)觀察 處死大鼠，將腎臟組織放置10% 甲醛溶液中固定，然后經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、蘇木素染色、脫水干燥等一系列過程，最后中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.2.4腎組織Nephrin蛋白變化情況 將各組大鼠腎臟組織去除筋膜后液氮冷凍研磨，將預(yù)冷的蛋白裂解液加入到研缽中提取蛋白并進(jìn)行蛋白濃度測定。隨后將蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離，再以恒流電轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，室溫條件下封閉1 h，再加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜，次日用1×TBS-T液洗滌3次，10 min/次，加入辣根酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，1×TBS-T液洗滌3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白表達(dá)情況。

1.2.5miR-146a、促炎因子[腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor- α，TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)]及纖維化因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)基因表達(dá)情況 干預(yù)治療4周后，處死大鼠，將腎臟組織去除筋膜后液氮冷凍研磨，隨后加入1 mL TRIzol試劑，小心吹吸后移入去酶EP管中，按照TRIzol試劑盒使用說明提取組織總RNA。Nanodrop ND-2000檢測RNA質(zhì)量和濃度。隨后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取cDNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測，PCR反應(yīng)條件按照廣州銳博試劑說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過相對(duì)定量△△Ct法進(jìn)行分析。

1.3細(xì)胞水平研究

1.3.1大鼠腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，HBZY-1)培養(yǎng) 分別在含有4.5 mmol/L 和25 mmol/L葡萄糖的含10%牛清的細(xì)胞培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，用于模擬正常生理環(huán)境和糖尿病高糖環(huán)境。

1.3.2不同培養(yǎng)條件下檢測miR-146a基因表達(dá)情況 在正常培養(yǎng)條件下，分別用0、5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L濃度姜黃素刺激HBZY-1細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞檢測miR-146a基因表達(dá)；分別在含有4.5 mmol/L(L-HC組)、15 mmol/L(M-HC組)和25 mmol/L葡萄糖(H-HC組)的含10%牛清的 DMEM 培養(yǎng)液條件下,收集細(xì)胞檢測miR-146a基因表達(dá)。

1.3.3轉(zhuǎn)染miR-146a minics后各項(xiàng)指標(biāo)檢測 在含有25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)條件下，待HBZY-1細(xì)胞達(dá)到 50%～70%的匯合率后，按照說明書要求將miR-146a minics進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染成功后，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-146a基因、靶基因Traf6和促炎因子、纖維化因子的表達(dá)情況；Western blot檢測p65蛋白變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1生化指標(biāo)和蛋白尿檢測情況 留取各組大鼠血清標(biāo)本和24 h尿液，利用試劑盒檢測BG、BUN、SCr和UACR含量。與N組比較，DN組BG、BUN、SCr和UACR均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CT組BG、BUN、SCr和UACR含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清BG、BUN、SCR水平及UACR水平比較Table 1 Comparison of BG,BUN,SCR and UACR among different groups

2.2各組大鼠病理切片情況 N組大鼠腎臟組織形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)清晰；DN組大鼠腎臟組織可見大量炎細(xì)胞浸潤，腎小管胞質(zhì)呈空泡狀；CT組腎臟結(jié)構(gòu)清晰，水腫消退，腎臟組織損傷緩解。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色( ×200)

2.3各組大鼠組織Nephrin蛋白和炎癥因子、纖維化因子表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示，與N組比較，DN組Nephrin蛋白表達(dá)降低；而與DN組相比，CT組Nephrin蛋白表達(dá)則升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與N組比較，DN組miR-146a表達(dá)降低，促炎因子TNF-α、IL-1β和纖維化因子TGF-β、collagen Ⅰ表達(dá)升高；而與DN組比較，CT組miR-146a表達(dá)則升高，細(xì)胞因子表達(dá)則降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組大鼠組織Nephrin表達(dá)情況

2.4不同培養(yǎng)條件下miR-146a基因表達(dá)情況 在含有4.5 mmol/L葡糖糖培養(yǎng)條件下，隨著姜黃素濃度增加，miR-146a基因表達(dá)增加，呈劑量依賴性；在含有不同糖濃度培養(yǎng)條件下，隨著糖含量增加，miR-146a mRNA表達(dá)降低，呈劑量依賴性。見表3，4。

2.5轉(zhuǎn)染miR-146a minics對(duì)miR146a和細(xì)胞因子表達(dá)的影響 將miR-146a minics和 negative control(NC)轉(zhuǎn)染到高糖培養(yǎng)條件下HBZY-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-146a minics的H-HC miR-146a組中， miR-146a的表達(dá)明顯高于H-HC miR-NC組，而H-HC組與H-HC miR-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與H-HC miR-NC組比較，H-HC miR-146a組中靶基因Traf6和促炎因子(TNF-α和IL-1β)、促纖維化因子(TGF-β和collagen Ⅰ)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表2 各組大鼠組織miR-146a mRNA及細(xì)胞因子表達(dá)情況比較Table 2 miR-146a mRNA and cytokine expression in rat tissues of each group

表3 不同姜黃素培養(yǎng)條件下miR-146a mRNA表達(dá)情況比較Table 3 miR-146a mRNA expression under different curcumin culture

表4 不同葡萄糖培養(yǎng)條件下miR-146a mRNA表達(dá)情況比較Table 4 miR-146a mRNA expression under different glucose culture

表5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中mRNA表達(dá)情況比較Table 5 After transfection,mRNA expression in cells of each group

2.6miR146a對(duì)NF-κB p65活化的影響 在高糖條件培養(yǎng)下的HBZY-1轉(zhuǎn)染miR-146a minics和negative control后，H-HC miR-146a組中p65蛋白表達(dá)水平明顯低于H-HC miR-NC組和H-HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3 。

圖3 各組細(xì)胞中p65表達(dá)水平情況

3 討 論

DN是機(jī)體代謝紊亂損傷微血管的一種內(nèi)分泌疾病。在高糖內(nèi)環(huán)境下，DN患者的腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生增殖、壞死，間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致腎功能損傷，最終發(fā)展為腎衰竭[8-9]。炎癥因子在DN發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用，是DN主要發(fā)病機(jī)制之一[10-12]。尿液中出現(xiàn)含有微量白蛋白標(biāo)志著腎臟出現(xiàn)損傷，腎功能下降。因此，蛋白尿可作為DN進(jìn)展的主要指證之一[13]。臨床上主要以降低血糖及控制炎癥為主的治療方案，減少蛋白尿改善DN患者的臨床癥狀。姜黃素屬于植物姜黃的主要成分之一，具有抑制促炎因子[4]、清除氧自由基[5]和控制血糖[6]等功能。本研究課題利用STZ誘導(dǎo)構(gòu)建DN大鼠模型[7]，發(fā)現(xiàn)DN組BG、BUN、SCr和UACR含量明顯高于N組，同時(shí)腎臟組織病理切片和Western blot檢測Nephrin蛋白水平，提示腎臟組織損傷。而當(dāng)利用姜黃素懸液干預(yù)治療DN大鼠，大鼠的BG、BUN、SCr和UACR含量明顯降低，腎臟損傷減輕或緩解，這表明姜黃素能夠緩解DN的腎臟損傷，從而腎功能得到改善。

微小RNA即MicroRNA，是廣泛分布在真核生物中的一類非編碼小RNA[14]。通過與靶基因信使RNA堿基配對(duì)實(shí)現(xiàn)降解信使RNA 或抑制信使RNA的翻譯表達(dá)，從而對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[15]。人體內(nèi)大約有3/5的編碼蛋白質(zhì)可以通過MicroRNA進(jìn)行調(diào)節(jié)，人類疾病的發(fā)生與MicroRNA表達(dá)的異常有著十分關(guān)鍵的聯(lián)系。miRNA-146a與炎癥性、纖維化性疾病具有一定相關(guān)性[16-17]。體外研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a mRNA表達(dá)與姜黃素、葡萄糖濃度呈劑量依賴性關(guān)系，姜黃素濃度越高，miR-146a相對(duì)表達(dá)量越高；而葡萄糖濃度越高，miR-146a 相對(duì)表達(dá)量越低。

miR-146a靶基因有Traf6和Irak1兩種基因，其可以通過調(diào)控靶基因表達(dá)來影響下游基因的表達(dá)[18]。在體外高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-146a mimics轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，人為上調(diào)miR-146a表達(dá)，檢測靶基因Traf6及其下游的NF-κB信號(hào)通路情況。發(fā)現(xiàn)，miR-146a mimics可以抑制靶基因Traf6 mRNA表達(dá)，同時(shí)其下游的NF-κB p65蛋白活性被抑制。NF-κB參與眾多炎癥信號(hào)通路，負(fù)責(zé)調(diào)控炎癥基因表達(dá)。炎癥因子異常表達(dá)在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。TNF-α和IL-1β可以導(dǎo)致腎臟系膜增生，腎臟纖維化[19]。在DN炎癥反應(yīng)中，NF-κB信號(hào)通路對(duì)其下游炎癥因子是否具有調(diào)控呢？結(jié)果顯示，隨著人為上調(diào)miR-146a基因表達(dá)，NF-κB p65蛋白表達(dá)降低，活性被抑制，有效的抑制其下游因子TNF-α和IL-1β等基因mRNA表達(dá)。

綜上所述，在DN發(fā)展過程中，姜黃素可以通過上調(diào)miRNA-146a mRNA表達(dá)，靶向調(diào)控Traf6抑制NF-κB 介導(dǎo)的促炎因子mRNA表達(dá)，一定程度上緩解DN大鼠腎臟損傷，改善腎臟功能，為臨床治療糖尿病腎病提供一定的基礎(chǔ)理論。