阿托伐他汀對阿霉素腎病大鼠氧化應激及klotho蛋白表達的影響

[摘要] 目的 研究阿托伐他汀對阿霉素腎病大鼠的保護作用，探討其機制是否與氧化應激及klotho蛋白表達相關。

方法 Wistar大鼠尾靜脈注射阿霉素（10 mg/kg）進行造模處理，造模成功后，分為模型組和干預組各18只。未造模大鼠標記為對照組。對照組及模型組大鼠每天用生理鹽水1 mL/kg灌胃，干預組每天用阿托伐他汀10 mg/kg灌胃，持續(xù)12周。分別于第4、8、12周測定24 h尿蛋白定量及血清清蛋白水平，同時處死大鼠取腎，進行腎組織病理學觀察，并測定腎組織氧化應激指標丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的表達水平和總抗氧化能力（T-AOC），用蛋白質印跡法（Western Blot）檢測klotho蛋白表達，實時熒光定量-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測klotho mRNA表達。

結果 模型組、干預組大鼠24 h尿蛋白定量高于對照組，干預組低于模型組，差異具有顯著意義（F=242.285～1 412.89，P<0.05）。模型組、干預組大鼠血清清蛋白水平低于對照組，干預組高于模型組，差異具有顯著性（F=58.265～240.54，P<0.05）。蘇木精-伊紅染色觀察顯示，相較于模型組，干預組大鼠腎小球病變減輕，腎小管細胞水腫程度降低。模型組大鼠腎組織MDA水平較對照組明顯升高，而干預組較模型組明顯降低（F=20.43～161.64，P<0.05）;干預組大鼠腎組織SOD、T-AOC水平均高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（F=4.97～604.10，P<0.05）。模型組和干預組大鼠腎組織klotho mRNA及klotho蛋白表達較對照組降低，而干預組較模型組表達升高，差異具有顯著性（F=173.88～964.23，P<0.05）。

結論 阿托伐他汀可以延緩阿霉素腎病大鼠的腎臟疾病進展，減輕氧化應激損傷，機制可能與上調klotho蛋白表達有關。

[關鍵詞] 阿托伐他汀;腎病;多柔比星;氧化性應激;klotho蛋白

[中圖分類號] R972.6;R692

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0450-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.020

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200806.1723.003.html;2020-08-07 11：24：54

EFFECT OF ATORVASTATIN ON OXIDATIVE STRESS AND KLOTHO PROTEIN EXPRESSION IN RATS WITH ADRIAMYCIN NEPHROPATHY

WANG Cheng， LIU Liqiu

（Department of Nephrology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the protective effect of atorvastatin on rats with adriamycin nephropathy and whether its possible mechanism is associated with oxidative stress and the expression of klotho protein.

Methods Wistar rats were given tail vein injection of adriamycin （10 mg/kg） to establish a model， and after successful modeling， the rats were divided into model group and intervention group， with 18 rats in each group. Unmodeled rats were selected as control group. The rats in the control group and the model group were given normal saline 1 mL/kg per day by gavage， and those in the intervention group were given atorvastatin 10 mg/kg per day by gavage， for 12 consecutive weeks. At weeks 4， 8， and 12 of intervention， 24 h urinary protein and serum albumin were measured， and the rats were sacrificed to collect the kidney for renal histopathological observation and measurement of the expression levels of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity （T-AOC） in renal tissue. Western blot was used to measure the protein expression of klotho， and quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to measure the mRNA expression of klotho.

Results The model group and the intervention group had significantly higher 24 h urinary protein than the control group， and the intervention group had significantly lower 24 h urinary protein than the model group （F=242.285-1 412.89，Plt;0.05）. The model group and the intervention group had a significantly lower se-rum level of albumin than the control group， and the intervention group had a significantly higher level than the model group （F=58.265-240.54，Plt;0.05）. Hematoxylin and eosin staining showed that compared with the model group， the intervention group had significant alleviation of glomerular lesions and a significant reduction in the degree of tubular cell edema. The model group had a significantly higher level of MDA in renal tissue than the control group， while the intervention group had a significantly lower level than the model group （F=20.43-161.64，Plt;0.05）， and compared with the model group， the intervention group had significantly hig-her levels of SOD and T-AOC in renal tissue （F=4.97-604.10，Plt;0.05）. The model group and the intervention group had significantly lower mRNA and protein expression of klotho than the control group， while the intervention group had significantly higher expression than the model group （F=173.88-964.23，Plt;0.05）.

Conclusion Atorvastatin may delay the progression of nephropathy and reduce oxidative stress injury in rats with adriamycin nephropathy， possibly by upregulating the protein expression of klotho.

[KEY WORDS]atorvastatin; adriamycin nephrosis; doxorubicin; oxidative stress; klotho protein

作為一種公認的可以模擬腎病綜合征的模型，阿霉素腎病具體機制尚不完全明確，其病理變化與人類腎病綜合征相類似。作為一種抗腫瘤藥物，由于具有多器官毒性，特別是腎臟毒性，阿霉素在臨床中的應用被大大限制[1]。阿霉素誘導毒性的分子機制是多因素的，至今沒有完全確定。到目前為止，最被接受的理論之一是它與氧化應激有關[2]。作為一種耐受性良好的降脂他汀類藥物，阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化等作用。已有研究表明，他汀類藥物可以有效改善阿霉素引起的心臟毒性[3]。但是，阿托伐他汀對阿霉素引起的腎臟毒性的保護作用尚存在爭議[4]。Klotho蛋白具有抑制細胞凋亡、抗氧化、抑制纖維化、調節(jié)離子轉運等多種生物學作用，對細胞氧化應激也具有保護作用[5]。基于以上研究現(xiàn)狀，本研究對阿霉素腎病大鼠進行不同時間的阿托伐他汀干預，檢測大鼠腎病進展情況，并檢測氧化應激指標丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和總抗氧化能力（T-AOC）以及klotho蛋白的變化情況，探討阿托伐他汀對阿霉素腎病大鼠的保護作用及其對腎臟氧化應激和klotho蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

雄性Wistar大鼠60只，8周齡，體質量（250±15）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于青島大學醫(yī)學部動物房。阿霉素購自美國Med Chem Express，阿托伐他汀鈣片（立普妥，每片20 mg）購自輝瑞制藥有限公司。MDA、SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，T-AOC試劑盒購自凱基生物公司，klotho抗體購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿霉素腎病大鼠模型建立及實驗動物分組

大鼠適應性喂養(yǎng)2周后，隨機選取20只作為對照組，其余40只大鼠給予尾靜脈注射阿霉素10 mg/kg進行造模處理，對照組給予等量生理鹽水。1周后檢測大鼠24 h尿蛋白，與對照組大鼠相比，尿蛋白升高有統(tǒng)計學意義視為造模成功。造模過程中有4只大鼠死亡。將剩余36只大鼠隨機分為模型組和干預組，每組18只。干預組大鼠每天給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃處理，模型組及對照組大鼠每天給予1 mL/kg的生理鹽水灌胃處理，持續(xù)12周。每周稱體質量1次，以調節(jié)藥物劑量。

1.2.2 24 h尿蛋白檢測 于實驗第4、8、12周，從每組隨機各取6只大鼠放入清潔代謝籠中，留取24 h尿液，檢測24 h尿蛋白定量。實驗重復3次，取均值。

1.2.3 腎臟標本的制備及血清清蛋白檢測 于實驗第4、8、12周，每組隨機各取6只大鼠。麻醉后，切取一側腎臟，-80 ℃保存;另一側腎臟置于40 g/L中性甲醛溶液中固定，待制備石蠟切片后進行腎組織病理學觀察。同時于心臟取血，以4 000 r/min高速離心，取血清用溴甲酚綠法檢測清蛋白水平。

1.2.4 腎組織病理學觀察 取出固定的腎臟組織，石蠟包埋后制備3 μm厚度切片。對切片進行二甲苯脫蠟處理，乙醇水洗，蘇木精染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來水浸泡，伊紅染色，常規(guī)脫水、透明、封片。用光學顯微鏡（奧林巴斯BX51TF）對染色切片進行觀察分析。

1.2.5 氧化應激指標檢測 采用脂質過氧化比色試劑盒測定大鼠腎組織MDA水平，采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定SOD水平，使用722分光光度計通過比色測定T-AOC。

1.2.6 實時熒光定量-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測klotho mRNA 用Trizol提取總RNA，用第一鏈cDNA合成試劑盒從2 μg總RNA中合成第一鏈cDNA。用SYBR Green PCR試劑在ABI 7500型熒光定量PCR儀中，以第一鏈cDNA為模板進行定量PCR。引物由Primer Premier 5.0軟件設計。Klotho-F引物序列為5′-TTTGCCCTATTT-CACCGAAG-3′，klotho-R引物序列為5′-CCTGA-CTGGGAGAGTTGAGC-3′。

1.2.7 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測klotho蛋白 從大鼠腎組織中提取蛋白質并進行Western Blot分析。制備SDS-PAGE 凝膠，電泳后轉膜，加一抗和二抗進行抗體反應，曝光顯影，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進行多組比較，然后采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較;相關性檢驗采用Spearson相關分析。

2 結" 果

2.1 造模后大鼠一般狀況

大鼠尾靜脈注射阿霉素1周后均出現(xiàn)不同程度腹瀉、食欲減退、消瘦、活動減少等表現(xiàn);2周后出現(xiàn)輕度水腫，以睪丸及足部最為明顯。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清清蛋白比較

隨時間延長，模型組和干預組大鼠24 h尿蛋白定量進行性升高。實驗第4、8、12周時，模型組、干預組大鼠24 h尿蛋白定量高于對照組，干預組低于模型組，差異具有顯著性（F=242.285～1 412.89，P<0.05）。模型組、干預組大鼠血清清蛋白水平低于對照組，而干預組高于模型組，差異具有顯著意義（F=58.265～240.54，P<0.05）。見表1、2。

2.3 腎組織病理學觀察

大體觀察顯示：對照組大鼠腎臟外觀紅潤;模型組大鼠腎臟腫大，包膜緊張，外觀蒼白;干預組大鼠腎臟輕度腫大，顏色輕度暗淡，略有光澤。對大鼠腎臟進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察可見：模型組腎小球右側小管區(qū)無結構、壞死，腎小管上皮細胞水腫，部分壞死、無核，管腔狹窄;干預組腎小管上皮細胞水腫減輕，壞死程度及范圍均小于模型組，細胞核損傷程度低于模型組。

2.4 各組大鼠氧化應激指標比較

隨時間推移，模型組大鼠腎組織MDA水平逐漸升高，干預組則逐漸降低;而SOD及T-AOC的變化趨勢與MDA相反。組間比較，模型組大鼠腎組織MDA水平較對照組明顯升高，而干預組較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=20.43～161.64，P<0.05）;干預組大鼠腎組織SOD、T-AOC水平均高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.97～604.10，P<0.05）。見表3～5。

2.5 各組大鼠klotho mRNA表達比較

模型組和干預組大鼠腎組織klotho mRNA表達較對照組降低，而干預組表達較模型組升高，差異有顯著性（F=253.21～964.23，P<0.05）。見表6。

2.6 各組大鼠klotho蛋白表達比較

模型組大鼠腎組織klotho蛋白的表達隨時間推移而降低，但干預組大鼠腎組織klotho蛋白的表達隨時間推移而升高。組間比較，模型組和干預組大鼠腎組織klotho蛋白較對照組表達降低，而干預組較模型組表達升高，差異均具有顯著意義（F=173.88～821.60，P<0.05）。見表7。

2.7 klotho蛋白表達與氧化應激指標關系

大鼠腎組織klotho蛋白表達與MDA含量呈負相關（r=-0.728，P<0.05），與SOD含量和T-AOC水平呈正相關（r=0.323、0.539，P<0.05）。見圖1。

3 討" 論

阿霉素腎病模型是目前公認的腎病綜合征動物模型，其發(fā)生機制尚不完全明確，可能與氧化應激有關。本實驗以Wistar大鼠為研究對象，應用阿霉素進行造模，通過檢測大鼠24 h尿蛋白定量及血清清蛋白顯示，阿托伐他汀可降低阿霉素腎病大鼠尿蛋白水平，并一定程度提高血清清蛋白水平，且HE染色顯示，干預組病變較模型組減輕，這提示阿托伐他汀可改善阿霉素腎病的病理損害。

在阿霉素腎病模型中，氧化應激是常見及重要的機制之一。MDA可間接反映體內的氧化應激水平。在本實驗中，經(jīng)過阿霉素造模處理后，模型組大鼠腎組織中MDA含量明顯升高，且隨時間推移逐漸增高。這是因為阿霉素腎病在無藥物治療情況下，會隨著時間推移而不斷進展惡化，所以MDA含量會持續(xù)升高。而經(jīng)過阿托伐他汀干預后，干預組MDA含量較模型組降低，并且隨時間推移而降低，表明阿托伐他汀可抑制氧化應激。這與有關研究結果相吻合[6]。SOD可以在分子、細胞水平防止和減輕機體組分受到過氧化損傷。Klotho蛋白可通過與胰島素樣生長因子（IGF）受體結合，增強SOD活性[7]。在阿霉素腎病中SOD活性受到抑制，故其清除氧自由基的作用明顯降低，氧自由基含量進一步升高[8]。阿霉素降低主動脈和腎臟SOD的表達，可能是氧化應激增強的原因之一。本實驗中模型組大鼠腎組織SOD的表達持續(xù)降低，與TAKENAKA等[9]的研究結果相一致。在抗氧化能力評估中，T-AOC測量比單個抗氧化劑濃度測量更為可靠[10]。本實驗結果表明，阿霉素會影響正常大鼠的抗氧化能力，而阿托伐他汀則會改善阿霉素腎病大鼠減弱的抗氧化能力。

Klotho蛋白由腎小管分泌，從間質進入Bowman囊和足細胞[11]。Klotho蛋白在腎臟中的表達水平最高[12]，它參與腎臟離子通道和轉運體的調節(jié)，以及腎臟1，25-二羥維生素D3的生成調節(jié)[13]。Klotho蛋白在維持細胞內穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用[14]，它通過抗炎癥、氧化應激和上皮間充質轉換（EMT）[15]，發(fā)揮對阿霉素腎病的保護作用。阿霉素腎病的發(fā)展可能與klotho的表達降低有關。本研究結果顯示，阿托伐他汀會上調klotho蛋白在阿霉素腎病狀態(tài)下表達。Klotho表達的調節(jié)可能與Rho通路有關。有研究表明，阿托伐他汀可以增強klotho基因的表達[16]。YOON等[17]研究認為，抑制Rho及其下游靶點Rho激酶也可能是他汀類藥物發(fā)揮作用的機制之一。他汀類藥物可通過RhoA滅活大鼠內髓質集合管上皮細胞，從而上調klotho mRNA的表達。Klotho蛋白在腎病綜合征病人體內水平的變化與氧化/抗氧化失衡有密切聯(lián)系，其表達水平下降可能是腎臟氧化損傷加重的原因之一。在氧化應激情況下，klotho可通過上調熱休克蛋白70（HSP70）表達來應對機體氧化應激狀態(tài)[18]。所以，誘導klotho基因表達可以挽救氧化應激所造成的腎組織損傷，而阿托伐他汀可能通過增強klotho的表達發(fā)揮抗氧化作用。

目前認為免疫反應、炎癥細胞浸潤與腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關，所以抗炎、抑制免疫治療是當前許多腎病的主要治療方法。糖皮質激素是現(xiàn)今應用最為廣泛的免疫-炎癥抑制劑，但在臨床上經(jīng)常會遇到糖皮質激素依賴或糖皮質激素抵抗，目前尚無好的解決方法。過去人們比較關注他汀類藥物通過發(fā)揮降脂作用保護腎臟，近年來越來越多地關注他汀類藥物的抗炎、免疫調節(jié)等非降脂腎臟保護作用。他汀類藥物能夠改善血管內皮細胞功能、抑制腎小球的增生肥大和腎小球系膜細胞增殖，并抑制系膜細胞轉化生長因子-β1（TGF-β1）、血管緊張素Ⅱ的表達和分泌，從而減少病人尿蛋白排泄量，改善其腎功能[19]。但是本實驗還顯示，阿托伐他汀可以調節(jié)腎臟中關鍵基因蛋白klotho的表達，改善阿霉素腎病的病理狀況，緩解其氧化應激損傷，這為臨床上治療腎病綜合征提供了思路。但是本實驗還存在一定的不足，如樣本量小、確切機制未研究清楚，還需要進一步研究以得到更加確切的結論。

綜上，本實驗結果表明，阿托伐他汀可以延緩并改善阿霉素腎病大鼠腎臟病理損害。阿霉素腎病大鼠腎臟受到氧化應激損傷，氧化應激標記物MDA、SOD及T-AOC異常表達，阿托伐他汀可一定程度糾正氧化應激損傷，其作用機制可能與上調腎臟中klotho蛋白表達有關。

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（本文編輯 馬偉平）