纖維素對(duì)結(jié)直腸癌小鼠腸道屏障功能及炎癥指標(biāo)影響

[摘要] 目的 探討纖維素對(duì)氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）模型小鼠結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用及其可能的機(jī)制。

方法 采用AOM/DSS建立結(jié)腸炎癥腫瘤模型后，給予不同纖維素含量的AIN-93M飼料，進(jìn)行干預(yù)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，計(jì)算各組小鼠抑瘤率。采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）法檢測小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1、Occludin、閉鎖帶-1（ZO-1）mRNA表達(dá)，Western blot法檢測結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達(dá)。

結(jié)果 纖維素低、中、高劑量組的抑瘤率分別為47.06%、61.34%、73.95%。與模型組相比，纖維素低、中、高劑量組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（F=13.34、162.21，P<0.05），而Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（F=40.55～152.56，P<0.05）。與模型組相比，纖維素低、中、高劑量組小鼠血清中TNF-α、COX-2的表達(dá)水平明顯降低（F=43.15、231.09，P<0.05），IL-12的表達(dá)水平明顯升高（F=243.45，P<0.05）。

結(jié)論 纖維素能夠顯著抑制炎癥性結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生，其可能的機(jī)制是通過改善腸道屏障功能和改善腸道炎癥達(dá)到抑癌作用。

[關(guān)鍵詞] 纖維素;結(jié)直腸腫瘤;炎癥;小鼠

[中圖分類號(hào)] R735.34;R343.93

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）03-0445-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.025

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200821.1555.002.html;2020-08-24 11：45：42

EFFECT OF CELLULOSE ON INTESTINAL BARRIER FUNCTION AND INFLAMMATORY MARKERS IN MICE WITH COLO-

RECTAL CANCER

LI Qianqian， CHEN Chen， LIU Xiaohan， CI Yifan，" SONG Yang

（School of Public Health， Qingdao University， Qingdao 266073， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the inhibitory effect of cellulose on the development and progression of colorectal cancer in a mouse model of colorectal cancer induced by azoxymethane （AOM）/dextran sodium sulfate （DSS） and its possible mechanism.

Methods After the model of colorectal cancer was established by AOM/DSS， the mice were fed with AIN-93M diet containing different contents of cellulose to perform an intervention experiment. The mice were sacrificed at the end of the experiment， and tumor inhibition rate was calculated for each group. RT-PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of Claudin-1， Occludin， and zonula occluden-1 （ZO-1） in colorectal tumor tissue， and ELISA was used to mea-

sure the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-12 （IL-12）， and cyclooxygenase-2 （COX-2） in serum.

Results The tumor inhibition rates in the low-， middle-， and high-dose cellulose groups were 47.06%，61.34%， and 73.95%， respectively. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose cellulose groups had significant reductions in the mRNA and protein expression of Claudin-1 （F=13.34，162.21;Plt;0.05） and significant increases in the mRNA and protein expression of Occludin and ZO-1 （F=40.55-152.56，Plt;0.05） in colorectal tumor tissue. Compared with the model group， the low-， middle-， and high-dose cellulose groups had significant reductions in the serum levels of TNF-α and COX-2 （F=43.15，231.09;Plt;0.05） and a significant increase in the serum level of IL-12 （F=243.45，Plt;0.05）.

Conclusion Cellulose can significantly inhibit the development of inflammatory colorectal cancer， possibly by improving intestinal barrier function and intestinal inflammation.

[KEY WORDS]cellulose; colorectal neoplasms; inflammation; mice

結(jié)直腸癌（CRC）是世界上第三大常見的癌癥，也是導(dǎo)致癌癥死亡的常見原因之一[1]。只有10%的CRC病例具有遺傳易感性，高達(dá)90%的病例無家族史或遺傳易感性[2]。與CRC發(fā)展有關(guān)的環(huán)境因素包括吸煙、酗酒、肥胖、久坐的生活方式、2型糖尿病、紅肉的攝入、高脂肪飲食和纖維攝入量不足等。慢性炎癥也是CRC發(fā)生的重要環(huán)境危險(xiǎn)因素之一[3]。有研究表明，一些促炎因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可以通過影響緊密連接（TJ）蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腸道黏膜屏障功能受損[4-5]。而腸道黏膜屏障功能受損，如腸上皮細(xì)胞完整性破壞、腸黏膜通透性增加等與炎癥相關(guān)[6]。腸道屏障功能受損和促炎因子共同作用，促進(jìn)了CRC的發(fā)生發(fā)展[7]。纖維素是一種不可溶性膳食纖維，主要存在于蔬菜和水果等植物組織中[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充纖維素可以減輕葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠炎癥，抑制其腫瘤的發(fā)生[9-10]。MOEN等[11]的研究結(jié)果也表明，纖維素能夠降低氧化偶氮甲烷（AOM）誘導(dǎo)的A/J Min+小鼠的腫瘤負(fù)荷。纖維素具有抗炎和抗腫瘤作用，其可能的機(jī)制是改善了腸道屏障功能，但目前相關(guān)研究尚少。因此，本研究通過建立小鼠結(jié)直腸炎癥腫瘤模型，探討不同纖維素濃度膳食對(duì)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、炎癥及腸道屏障功能的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)C57BL/6小鼠100只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（質(zhì)量合格證號(hào)：37009200015329），飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。AOM購自美國SIGMA公司。DSS購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。纖維素購自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。小鼠飼料購自江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司，在標(biāo)準(zhǔn)AIN-93M飼料的基礎(chǔ)上，脫去或調(diào)整纖維素含量制成含0、25、50及100 g/L纖維素的AIN-93M飼料。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過（倫審批件號(hào)：QYFYWZLL25668）。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 采用AOM/DSS建立結(jié)腸炎癥腫瘤模型。第1天，小鼠腹腔注射濃度為1 g/L的AOM 10 mg/kg，7 d后，飲水給予20 g/L的DSS，自由飲水7 d，間隔14 d，循環(huán)3個(gè)周期，完成模型制備。

1.2.2 動(dòng)物分組及其干預(yù)措施 將100只雄性C57BL/6小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組（CG組，標(biāo)準(zhǔn)AIN-93M飼料喂養(yǎng)）、模型組（MG組，不含纖維素的飼料喂養(yǎng)）、纖維素低劑量組（LCEG組，含25 g/L纖維素飼料喂養(yǎng)），纖維素中劑量組（MCEG組，含50 g/L纖維素飼料喂養(yǎng)）和纖維素高劑量組（HCEG組，含100 g/L纖維素飼料喂養(yǎng)），每組20只。用標(biāo)準(zhǔn)AIN-93M飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，各組小鼠給予不同纖維素含量的AIN-93M飼料，預(yù)防性飲食干預(yù)2周后，模型組及纖維素低、中、高劑量組小鼠建立AOM/DSS模型。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠給予相應(yīng)的AIN-93M鼠糧干預(yù)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)持續(xù)13周。

1.2.3 小鼠一般狀態(tài)及腫瘤發(fā)生情況觀察 每周記錄小鼠體質(zhì)量，每2 d記錄小鼠進(jìn)食進(jìn)水量，觀察各組小鼠精神、活動(dòng)、毛色、飲食和排泄物等情況。于末次干預(yù)后24 h，眼球摘除取血;頸椎脫臼處死小鼠，剝離結(jié)直腸組織，剖開小鼠結(jié)直腸，記錄腫瘤發(fā)生數(shù)（腫瘤最大直徑≥2 mm），按下列公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（模型組腫瘤平均數(shù)量-纖維素干預(yù)組腫瘤平均數(shù)量）/模型組腫瘤平均數(shù)量×100%。

1.2.4 小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和閉鎖帶-1（ZO-1）mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）方法分別檢測小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)水平。用TRIzol試劑提取組織總RNA，用IMPLEN納米光度計(jì)、P-330核酸檢測儀測定mRNA濃度和純度。本研究中A260/A280比值范圍為1.90～2.00，說明樣品質(zhì)量良好。使用Primer Script RT Reagent Kit和Bio-Rad MyCycler PCR儀反向轉(zhuǎn)錄RNA（2 μg）。

PCR引物序列見表1。PCR通過Eppendorf Mastercycler EP梯度系統(tǒng)（Eppendorf）根據(jù)制造商說明進(jìn)行操作。反應(yīng)體積20 μL，進(jìn)行兩步循環(huán)，包括95 ℃的變性步驟和60 ℃的退火/延伸聯(lián)合步驟。GADPH作為內(nèi)參基因。使用比較式2-△△ct計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.5 小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平。取50～100 mg腫瘤組織，用無菌手術(shù)剪將組織剪成細(xì)小的碎片，然后加入含磷酸酶抑

制劑的RIPA裂解液，提取腫瘤組織的總蛋白。用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。測定完成后向各組蛋白中加入上樣緩沖液，混勻，加熱使蛋白變性。蛋白冷卻后加入SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，將分離后的蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。再用含脫脂奶粉的TBST封閉2 h，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后加入二抗孵育2 h。加入ECL發(fā)光液在Fusion FX5顯影儀中顯影，得到目的蛋白條帶。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.6 小鼠血清中TNF-α、白細(xì)胞介素-12（IL-12）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）的檢測 按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm波長處各孔吸光度值，按稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中細(xì)胞因子含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)及腫瘤發(fā)生情況

除CG組外，在飲水中加入20 g/L的DSS期間及之后1周內(nèi)，其他各組小鼠均出現(xiàn)毛色無光澤，呈靜電樣改變，活動(dòng)減少，糞便性狀改變，以及稀便、脫肛、血便等癥狀。但隨著正常飲水，以上現(xiàn)象均會(huì)改善。CG、MG、LCEG、MCEG和HCEG組小鼠的存活率分別為100%（20/20）、55%（11/20）、75%（15/20）、85%（17/20）和90%（18/20）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后解剖小鼠，觀察并記錄腫瘤的發(fā)生情況。LCEG、MCEG、HCEG組小鼠結(jié)直腸腫瘤數(shù)量較MG組減少，MCEG、HCEG組較LCEG組減少，HCEG組較MCEG組減少，差異均有顯著意義（F=93.23，P<0.05）。LCEG、MCEG和HCEG組的抑瘤率分別為47.06%、61.34%和73.95%。見表2。

2.2 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)比較

研究結(jié)果表明，MG組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中的Claudin-1 mRNA表達(dá)水平較CG組明顯升高，而LCEG、MCEG、HCEG組Claudin-1 mRNA表達(dá)水平較MG組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.34，P<0.05）。MG組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中的Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)水平較CG組明顯降低，而MCEG、HCEG組Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)水平較MG組明顯升高，差異均有顯著性（F=152.56、65.30，P<0.05）;MG組和LCEG組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中ZO-1、Occludin mRNA表達(dá)水平差異無顯著性（P>0.05）。見表3。

2.3 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的比較

MG組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1蛋白表達(dá)水平較CG組明顯升高，LCEG、MCEG、HCEG組Claudin-1蛋白表達(dá)水平較MG組明顯降低，差異均有顯著性（F=162.21，P<0.05）。MG組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平較CG組明顯降低，LCEG、MCEG、HCEG組Occludin 蛋白表達(dá)水平較MG組明顯升高，MCEG、HCEG組ZO-1蛋白表達(dá)水平較MG組明顯升高，差異均有顯著性（F=115.12、40.55，P<0.05）;而MG組和LCEG組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中ZO-1 蛋白表達(dá)水平差異無顯著性（P>0.05）。見圖1、表4。

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子表達(dá)的比較

與CG組相比，MG、LCEG、MCEG和HCEG組小鼠血清中TNF-α、COX-2的表達(dá)水平明顯升高，IL-12的表達(dá)水平明顯降低;與MG組相比較，LCEG、MCEG和HCEG組小鼠血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯降低，IL-12的表達(dá)水平明顯升高，MCEG和HCEG組小鼠血清中COX-2的表達(dá)水平明顯降低（F=43.15～243.45，P<0.05）。MG組和LCEG組小鼠血清中COX-2的表達(dá)水平差異無顯著性（P>0.05）。見表5。

3 討" 論

研究表明，纖維素可以減輕腸道炎癥和抑制腫瘤發(fā)生[8-9]。本研究通過AOM/DSS誘導(dǎo)成功建立小鼠結(jié)直腸炎癥腫瘤模型，用含不同濃度纖維素的飼料進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與MG組相比，纖維素干預(yù)能夠使AOM/DSS誘導(dǎo)的CRC小鼠的腫瘤數(shù)量降低，增加結(jié)直腸腫瘤的抑瘤率。另外，本研究還顯示，纖維素干預(yù)能夠影響小鼠結(jié)直腸腸道屏障功能。

TJ由跨膜蛋白（如Occludins、Claudins）和連接黏附分子以及外周膜蛋白（如zona occludens，ZO-1、-2、-3）等組成[10]。在健康狀態(tài)下，TJ蛋白能夠構(gòu)建一種動(dòng)態(tài)的腸道屏障，調(diào)節(jié)細(xì)胞間隙對(duì)水、營養(yǎng)物質(zhì)和電解質(zhì)的攝取。而TJ功能障礙可以破壞腸道屏障的完整性，促進(jìn)腸道炎癥以及結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生[11]。Claudin-1能啟動(dòng)TJ結(jié)構(gòu)的形成活性，其過度表達(dá)可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞分化，使腸黏膜受損[12]。Occludin在胞外環(huán)和跨膜區(qū)選擇性調(diào)節(jié)細(xì)胞間隙的通透性[13]。ZO-1能夠與Occludin相結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞間隙通透性，在細(xì)胞間具有黏附作用[14]。下調(diào)ZO-1的表達(dá)，能夠阻斷和破壞TJ復(fù)合體的完整性，增加上皮通透性[15]。

慢性炎癥和癌癥之間的聯(lián)系密切[2]。炎癥性腸?。↖BD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩病（CD），該病病人患CRC的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[16]。有研究顯示，與健康對(duì)照組相比，UC病人結(jié)腸組織中Claudin-1蛋白表達(dá)上調(diào)[17]。PORITZ等[18]的研究結(jié)果也顯示，UC病人結(jié)腸樣本中Claudin-1蛋白的表達(dá)增加，Occludin蛋白的表達(dá)減少。KUCHARZIK等[19]的研究則顯示，UC和CD病人結(jié)直腸組織中的Occludin蛋白表達(dá)下調(diào)。SOLER等[20]研究表明，在人類和大鼠中，腸腫瘤周圍區(qū)域的TJ通透性增加;在人類腸道的腫瘤豐富區(qū)域TJ蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)減少。纖維素能夠改善腸道黏膜屏障功能，抑制腸道炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9]。與上述研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果也顯示，AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1的表達(dá)水平明顯升高，Occludin、ZO-1的表達(dá)水平明顯降低;纖維素干預(yù)后，Claudin-1的表達(dá)水平明顯降低，Occludin、ZO-1的表達(dá)水平明顯升高。表明AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠，其TJ功能受損，結(jié)直腸腸道屏障的完整性被破壞，而纖維素的干預(yù)使TJ功能得到一定程度的恢復(fù)，從而保護(hù)腸道屏障的完整性。

腸黏膜屏障功能受損可能與腸道炎癥有關(guān)，因此本研究還檢測了小鼠血清中的炎癥相關(guān)指標(biāo)。TNF-α可以通過增加肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化影響TJ，降低上皮屏障功能[21]。本文研究結(jié)果顯示，AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯升高，在纖維素干預(yù)后，小鼠血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯降低，腸道炎癥改善。表明纖維素干預(yù)可能通過調(diào)控炎癥因子TNF-α表達(dá)，改善腸道屏障功能。IL-12在抗腫瘤免疫及抗感染免疫中起重要作用，與正常人相比，CRC病人外周血中IL-12的表達(dá)水平明顯降低[22]。本研究中，IL-12在結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中的表達(dá)水平明顯降低，在纖維素干預(yù)各組中的表達(dá)水平明顯升高。COX-2在炎癥過程中是重要的限速酶，其高表達(dá)與慢性炎癥和腫瘤的發(fā)生有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中COX-2的表達(dá)水平明顯升高，在纖維素干預(yù)組中其表達(dá)水平明顯降低。可見，纖維素干預(yù)可使結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠的腸道炎癥減輕。

綜上所述，纖維素干預(yù)能夠減少AOM/DSS誘導(dǎo)的模型小鼠的腫瘤數(shù);降低小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1的表達(dá)，升高Occludin、ZO-1的表達(dá)，改善腸道屏障功能;降低小鼠血清中TNF-α、COX-2的表達(dá)水平，升高IL-12的表達(dá)水平，減輕腸道炎癥。纖維素干預(yù)可能通過改善AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠的腸道屏障功能，減輕其腸道炎癥，而抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。但相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）