低幅度機械牽張力誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化的作用

[摘要] 目的 探討低幅度機械牽張力對肌成纖維細(xì)胞再分化的誘導(dǎo)作用及增生性瘢痕的轉(zhuǎn)歸機制。

方法

體外培養(yǎng)健康人皮膚成纖維細(xì)胞，應(yīng)用10%幅度牽張力誘導(dǎo)構(gòu)建肌成纖維細(xì)胞模型。實驗分為陰性對照組、陽性對照組、實驗組，以人正常成纖維細(xì)胞為陰性對照組，應(yīng)用2%幅度牽張力體外培養(yǎng);以肌成纖維細(xì)胞作為實驗組和陽性對照組，分別應(yīng)用2%、10%幅度牽張力繼續(xù)體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞再分化。實驗第7天，應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，SYBR Green qPCR法檢測整合素β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)，ELISA法檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原含量;Western-Blot法檢測整合素β1、α-SMA蛋白表達(dá)量。

結(jié)果 與陰性對照組比較，實驗組肌成纖維細(xì)胞的增殖能力增高（F=67.75，Plt;0.05），細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、Ⅰ型膠原的蛋白含量、α-SMA的蛋白表達(dá)及各指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平均增高（F=132.64～981.60，Plt;0.05），細(xì)胞內(nèi)整合素β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）;陽性對照組和實驗組肌成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）;而陽性對照組肌成纖維細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、Ⅰ型膠原的mRNA和蛋白含量與整合素β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較實驗組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。

結(jié)論 低幅度牽張力不能誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化，可能存在其他機制介導(dǎo)了張力誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化的過程。

[關(guān)鍵詞] 機械張力;肌成纖維細(xì)胞;成纖維細(xì)胞;細(xì)胞分化;瘢痕

[中圖分類號] R329.24

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0432-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.017

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200802.1242.004.html;2020-08-04 10：18：36

EFFECT OF LOW-AMPLITUDE MECHANICAL STRAIN IN INDUCING THE REDIFFERENTIATION OF MYOFIBROBLASTS

AN Yu， HAO Rongan， KUANG Ruixia， HU Chunnan， CHEN Lu， WANG Zhiguo

（Department of Burns and Plastic Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To explore the effect of low-amplitude mechanical strain in inducing the redifferentiation of myofibroblasts， and to investigate the prognostic mechanism of hyperplastic scars.

Methods Fibroblasts from the skin of healthy people were cultured in vitro， and a model of myofibroblasts was established by applying a strain at an amplitude of 10%. The experiment included three groups， i.e.， negative control group， positive control group， and experimental group. Normal human fibroblasts were taken as the negative control group， which were subjected to a strain at an amplitude of 2% when cultured in vitro. Myofibroblasts， which were subjected to a strain at amplitudes of 2% and 10% to induce cell redifferentiation during in vitro culture， were taken as the experimental group and positive control group， respectively. On day 7 of the experiment， the CCK-8 was used to determine the proliferative capacity of cells; SYBR Green qPCR assay was used to determine the mRNA expression of integrin β1， transforming growth factor β1 （TGF-β1）， alpha-smooth muscle actin （α-SMA）， and type Ⅰ collagen; enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the content of TGF-β1 and type Ⅰ collagen; Western Blot was used to determine the protein expression of integrin β1 and α-SMA.

Results Compared with the negative control group， the experimental group had significantly increased proliferative capability of myofibroblasts （F=67.75，Plt;0.05） and significantly increased protein content of TGF-β1 and type Ⅰ collagen， protein expression of α-SMA， and mRNA expression of the three indicators in the cells （F=132.64-981.60，Plt;0.05）， but there were no significant differences in the mRNA and protein expression levels of integrin β1 in cells between the two groups （Pgt;0.05）. There were no significant differences in the mRNA and protein expression of α-SMA in myofibroblasts between the positive control group and the experimental group （Pgt;0.05）， while the former group had significantly higher mRNA expression and protein content of TGF-β1 and type Ⅰ collagen and mRNA and protein expression of integrin β1 in myofibroblasts than the latter group （Plt;0.05）.

Conclusion Low-amplitude mechanical strain cannot induce the redifferentiation of myofibroblasts. The strain-induced redifferentiation of myofibroblasts may be mediated by some other mechanisms.

[KEY WORDS]mechanical stretch; myofibroblasts; fibroblasts; cell differentiation; cicatrix

肌成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性是決定病理性瘢痕發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的重要機制[1]。誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化為其他類型的細(xì)胞可能是治療病理性瘢痕的有效方法之一。機械張力是導(dǎo)致病理性瘢痕形成的重要因素[2]。創(chuàng)面愈合初期，高張力下的創(chuàng)面刺激成纖維細(xì)胞大量增殖聚集，成纖維細(xì)胞高表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），分化為肌成纖維細(xì)胞來維持細(xì)胞內(nèi)外的力學(xué)平衡[3]。而創(chuàng)面愈合后期，伴隨著創(chuàng)周張力的降低，肌成纖維細(xì)胞逐漸再分化、凋亡最終形成成熟瘢痕，或在持續(xù)高張力作用下持續(xù)異常增殖而形成病理性瘢痕[4]。機械張力參與了肌成纖維細(xì)胞形成與再分化的全部過程。在前期研究中，我們應(yīng)用力學(xué)技術(shù)成功誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，構(gòu)建肌成纖維細(xì)胞力學(xué)模型，闡明了機械張力在瘢痕形成過程中的作用及其機制[4-7]。本文研究探討肌成纖維細(xì)胞在微張力作用下的轉(zhuǎn)歸情況，為研究病理性瘢痕的轉(zhuǎn)歸提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要實驗儀器及試劑

多通道細(xì)胞應(yīng)力加載儀（BF-3001C;Flex-cell公司，美國）;6孔彈性基底膜培養(yǎng)板（BF-3001C;Flex-cell公司，美國）;CO2培養(yǎng)箱（Panasonic公司，日本）;倒置光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）;酶聯(lián)免疫檢測儀（BioTek公司，美國）;ABI ViiATM 7 SYBR Green qPCR儀（ABI公司，美國）;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ALPHA FCE公司，美國）。Eagle培養(yǎng)基（CORNING公司，美國）、FBS、含EDTA的胰酶（Gibco公司，美國）;Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（同仁化學(xué)，日本）;ELISA試劑盒（Ramp;D Systems公司，美國）;TRIzol試劑（Ambion公司，美國）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）;PCR引物及其序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成;

整合素β1、α-SMA兔抗人單克隆抗體（Abcam公司，英國），山羊抗兔二抗（Abgent公司，蘇州），PVDF膜、ECL發(fā)光液（Millipore公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人體背部正常皮膚標(biāo)本3例均取自青島大學(xué)附屬醫(yī)院美容整形外科行色素痣切除術(shù)的病人，均為女性，年齡分別為26、36、41歲。本文研究通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有病人均簽署知情同意書。應(yīng)用組織塊法體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

調(diào)整細(xì)胞懸液密度至1×107/L，均勻地接種于6孔彈性基底膜培養(yǎng)板，每孔2 mL。于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)30%后，更換培養(yǎng)基。根據(jù)前期研究方法構(gòu)建肌成纖維細(xì)胞模型[4]，設(shè)置加載機械張力參數(shù)為：拉伸幅度10%，加力頻率0.1 Hz，加力波形為正弦波，加載機械張力7 d。實驗分為陰性對照組、陽性對照組、實驗組。陰性對照組：正常皮膚成纖維細(xì)胞，加載2%幅度牽張力;陽性對照組：肌成纖維細(xì)胞，加載10%幅度牽張力;實驗組：肌成纖維細(xì)胞，加載2%幅度牽張力。各組加載牽張力時間為7 d， 37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔2 d每孔補充含體積分?jǐn)?shù)0.10血清培養(yǎng)液0.5 mL。每組實驗重復(fù)3次。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 加力結(jié)束后，各組取3孔細(xì)胞，每孔加入CCK-8試劑200 μL，輕搖培養(yǎng)板將試劑混勻后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。分別取200 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于96孔板中，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白孔，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm波長處吸光度值，以其表示細(xì)胞數(shù)量。

1.3.2 SYBR Green qPCR法檢測細(xì)胞內(nèi)整合素β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、α-SMA和Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá) 加力結(jié)束后，各組取3孔細(xì)胞，應(yīng)用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，行SYBR Green qPCR檢測。PCR反應(yīng)體系20 μL，內(nèi)含有：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，滅菌蒸餾水6 μL，cDNA溶液2 μL。應(yīng)用ABI ViiATM 7 SYBR Green qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s重復(fù)45個循環(huán)。擴(kuò)增完成后，應(yīng)用ABI ViiATM 7軟件對反應(yīng)產(chǎn)物的熔解曲線進(jìn)行自動定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參，各引物序列見表1。采用相對定量法2-ΔΔCt計算各目的基因的mRNA含量。ΔΔCt=（Ct目的-Ct內(nèi)參）-（Ct對照-Ct內(nèi)參）。

1.3.3 ELISA法檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原含量 收集各組培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞上清液，按照TGF-β1、Ⅰ型膠原ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 Western-Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)整合素β1、α-SMA蛋白表達(dá)量 加力結(jié)束后，各組取3孔細(xì)胞，將蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑按100∶1的比例制成混合溶液，裂解細(xì)胞30 min后，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，測定后加入1/4樣品體積量的上樣緩沖液，95 ℃金屬浴5 min后室溫備用。調(diào)整電泳參數(shù)為：濃縮膠80 V、30 min，分離膠120 V、60 min。取出凝膠后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜參數(shù)280 mA 140 min。整合素β1、α-SMA一抗稀釋濃度為1∶5 000，內(nèi)參β-actin稀釋濃度為1∶1 500;二抗稀釋濃度為1∶10 000。加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫下孵育1 h后，涂ECL發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)測定各種蛋白條帶的灰度值，以灰度值和條帶面積的乘積（IntDen）進(jìn)行蛋白半定量的分析。蛋白的相對表達(dá)量=實驗組（IntDen目的-IntDen內(nèi)參）/對照組（IntDen目的-IntDen內(nèi)參）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS R23.0.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較

各組細(xì)胞增殖能力相比較，陽性對照組gt;實驗組gt;陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=67.75，Plt;0.05），見表2。

2.2 各組整合素β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

陽性對照組整合素β1 mRNA和蛋白表達(dá)高于實驗組（F=807.45、90.23，q=47.86、2.53，Plt;0.05），實驗組和陰性對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。見表2。

2.3 各組TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的比較

各組TGF-β1、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白含量比較，陽性對照組gt;實驗組gt;陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=132.63～981.60，Plt;0.05）。實驗組α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)高于陰性對照組，差異有顯著性（F=496.01、132.64，q=37.43、16.95，Plt;0.05），實驗組和陽性對照組α-SMA蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。見表2，圖1。

3 討" 論

肌成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性是決定增生性瘢痕發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的重要機制[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，肌成纖維細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞[8]。誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化為其他類型細(xì)胞，可能是治療病理性瘢痕的有效手段之一。

機械張力是影響創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的重要因素[9]。創(chuàng)面愈合早期，皮膚完整性遭到破壞，創(chuàng)面承受機械張力驟增，刺激炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞大量增殖聚集[10];組織再生期，皮膚成纖維細(xì)胞在張力作用下表達(dá)α-SMA，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)成分，分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞籍α-SMA維持細(xì)胞內(nèi)外之間的力學(xué)平衡狀態(tài)[3，11];創(chuàng)面愈合后期，肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸決定了創(chuàng)面愈合的最終結(jié)果。研究表明，如果創(chuàng)面修復(fù)后不再承受較大的機械張力刺激，肌成纖維細(xì)胞逐漸再分化、凋亡，創(chuàng)面最終形成成熟的瘢痕[12];如果創(chuàng)面持續(xù)承受較大的機械張力刺激，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)增殖，創(chuàng)面就會形成病理性瘢痕[3，13]。

創(chuàng)面愈合的不同結(jié)局提示機械張力參與了肌成纖維細(xì)胞形成與再分化的全部過程[14-15]。細(xì)胞對機械張力的反應(yīng)有一定選擇性，在比較適合的張力作用下才會產(chǎn)生明顯的力學(xué)-生化信號傳導(dǎo)。有研究表明，在牽張力幅度低于2%時，真皮成纖維細(xì)胞不會發(fā)生形態(tài)學(xué)變化[16]，本文陰性對照組結(jié)果與其一致。因此，我們推測低幅度牽張力可能會誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化。

足夠大的張力微環(huán)境和TGF-β1是誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞形成的兩個必要條件[17-18]。整合素-細(xì)胞骨架信號通路是機械張力傳導(dǎo)的主要途徑[17-20]。整合素胞外區(qū)域與其特異的細(xì)胞外基質(zhì)配體結(jié)合后，就會導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白聚集，形成黏著復(fù)合體，黏著復(fù)合體可以成熟為更大的黏著斑（FA）。只有形成足夠大的FA，成纖維細(xì)胞才開始表達(dá)α-SMA[21]。整合素、FA、α-SMA都是張力的傳導(dǎo)者，負(fù)責(zé)把力學(xué)信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)影響基因表達(dá)[22]。同時，足夠大的機械張力才能通過整合素激活細(xì)胞外基質(zhì)中潛伏狀態(tài)的TGF-β1，活化的TGF-β1通過SMAD信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)[23-24]。

肌成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA、TGF-β1表達(dá)水平較高，而皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)少量的TGF-β，且?guī)缀醪槐磉_(dá)α-SMA[25]。機械張力使成纖維細(xì)胞大量分泌TGF-β1，TGF-β1可協(xié)同機械張力的作用促使細(xì)胞表達(dá)α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型膠原，促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[26-27]。與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)能力較高，突出表現(xiàn)為α-SMA、TGF-β1、Ⅰ型膠原等重要分子標(biāo)志物的表達(dá)水平提高[28-29]。

基于前期研究結(jié)果，本文構(gòu)建肌成纖維細(xì)胞模型作為本次研究的目的細(xì)胞，選擇10%和2%幅度的牽張力作為高、低幅度牽張力作用于肌成纖維細(xì)胞，以正常成纖維細(xì)胞持續(xù)加載2%幅度的牽張力為陰性對照組。本文研究結(jié)果顯示，10%幅度的牽張力明顯刺激肌成纖維細(xì)胞增殖，2%幅度的牽張力作用下肌成纖維細(xì)胞的增殖能力高于正常成纖維細(xì)胞，再次證明張力對成纖維細(xì)胞具有促增殖的作用。同時，在2%幅度牽張力作用下，肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)整合素β1基因和蛋白表達(dá)水平明顯低于10%幅度牽張力作用下的水平，說明細(xì)胞對較低幅度牽張力的傳導(dǎo)效應(yīng)較弱，與我們前期的研究結(jié)果一致。理論上講，低幅度牽張力作用下，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)會降低，生化反應(yīng)隨之減弱。本文的研究結(jié)果顯示，2%幅度牽張力作用7 d后，肌成纖維細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型膠原的基因和蛋白表達(dá)水平低于10%幅度牽張力作用，仍然高于正常成纖維細(xì)胞表達(dá)水平;肌成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)水平仍然較高。這一結(jié)果說明，低張力微環(huán)境下肌成纖維細(xì)胞沒有發(fā)生明顯變化，這與臨床上病理性瘢痕的轉(zhuǎn)歸現(xiàn)象不符。因為體外培養(yǎng)不能完全模擬體內(nèi)細(xì)胞所處的復(fù)雜環(huán)境，推測低幅度牽張力不能直接誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞的再分化，可能存在其他機制介導(dǎo)了張力誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化的過程。

綜上所述，在2%幅度牽張力作用下，肌成纖維細(xì)胞仍然高表達(dá)α-SMA、TGF-β1和Ⅰ型膠原，肌成纖維細(xì)胞的表型沒有發(fā)生本質(zhì)變化。低幅度牽張力作用不能直接誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化，與機體復(fù)雜內(nèi)環(huán)境有關(guān)，也可能存在其他機制參與了張力誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞再分化的過程，仍需要深入研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）