丙泊酚對滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲的影響及相關(guān)機制研究

劉佳

滋養(yǎng)細胞來自胚胎外滋養(yǎng)層，具有滋養(yǎng)功能，妊娠早期滋養(yǎng)細胞侵入母體蛻膜間質(zhì)與血管，使螺旋動脈發(fā)生重鑄，保證胎盤正常形成與妊娠進展[1]。滋養(yǎng)細胞與惡性腫瘤細胞有諸多相似性，高度增殖、侵襲遷移及逃避免疫系統(tǒng)攻擊，在流產(chǎn)、先兆子癇等妊娠病理情況中發(fā)揮重要作用[2]。丙泊酚是臨床常用麻醉劑，有研究顯示，丙泊酚可降低流產(chǎn)率，逆轉(zhuǎn)流產(chǎn)胎盤，蛻膜結(jié)構(gòu)的病理改變，可能對滋養(yǎng)細胞的惡性增殖發(fā)揮抑制作用[3,4]。磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)是生長因子激活的受體酪氨酸激酶和G蛋白受體重要的下游信號成分。研究顯示多種母胎界面的生長因子可激活PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路促進細胞增殖、侵襲過程[5,6]，丙泊酚是否通過PI3K/Akt信號通路對滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲功能進行調(diào)控。本研究通過體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞系JEG-3，檢測丙泊酚對JEG-3細胞增殖、侵襲的影響，并使用PI3K抑制劑LY294002進行實驗，旨在探討丙泊酚對滋養(yǎng)細胞惡性增殖的調(diào)控作用，為丙泊酚的合理利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：人細胞外滋養(yǎng)細胞株JEG-3購自中國科學(xué)院上海生物研究所。主要試劑及來源：12%胎牛血清、胰酶、DMEM/F12培養(yǎng)基購自上海語純生物科技有限公司；CCK8相關(guān)試劑購自上海翊圣生物有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自美國sigma公司；鼠抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、金屬基質(zhì)蛋白酶2(metallopro-teinase 2，MMP-2)、金屬基質(zhì)蛋白酶9(metalloproteinase 9，MMP-9)、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白購自上海強耀生物科技有限公司；Transwell相關(guān)試劑購自美國BD公司；ECL化學(xué)發(fā)光劑試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；核酸蛋白測定儀及凝膠成像儀購自德國Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱購自上海丙林電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):以5×105/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，使用含有12%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞融合胰酶消化，PBS洗滌傳代。以5×105/cm2接種于6孔板，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.2.2 細胞分組:加入不同濃度的丙泊酚(1 μg/ml、4 μg/ml、7 μg/ml)，以未加丙泊酚處理細胞作為對照組，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力:收集1.2.2中各組培養(yǎng)細胞，分別接種至96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8試劑，4 h后在酶標(biāo)儀上測定450 mn 處的吸光度值。每組均6個復(fù)孔。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力:Transwell侵襲實驗：將基質(zhì)膠與不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶8的比例混合稀釋后包被在上層小室并風(fēng)干過夜，在上室中接種1.2.2中各組重懸細胞(細胞密度2×106/ml)，下室加入600 μl RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的FBS)。培養(yǎng)24 h后去除小室，棉簽擦除上室基質(zhì)膠與細胞，甲醛固定15 min后0.1%結(jié)晶紫染色，用倒置顯微鏡隨機選取5個視野并拍照，取平均值。Transwell遷移試驗：除不加入基質(zhì)膠外，其他步驟與侵襲試驗完全相同。

1.2.5 免疫印跡法(western blotting，WB)檢測細胞增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達:收集1.2.2中各組細胞，經(jīng)蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，通過BCA蛋白試劑盒檢測細胞總蛋白含量，取蛋白樣品10～20 μl，經(jīng)凝膠分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉1 h，加入一抗，均為1∶1 000稀釋，4℃過夜；TBST洗滌后，加入二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1～2 h，經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光顯影，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照并進行定量分析。實驗重復(fù)6次，取平均值。

1.2.6 PI3K/Akt信號抑制劑對細胞增殖、侵襲遷移的影響:收集1.2.2中對照組細胞及丙泊酚7 μg/ml組細胞，各自分成2份，其中1份不做處理，另1份加入終濃度為30 μmol/L的PI3K/Akt信號通路特異性抑制劑LY294002共培養(yǎng)，按照1.2.3與1.2.4中方法檢測各組細胞增殖、侵襲遷移能力，按照1.2.5中方法檢測細胞PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 滋養(yǎng)細胞增殖能力測定 與對照組比較，同一時間內(nèi)丙泊酚1 μg/ml組、丙泊酚4 μg/ml組、丙泊酚7 μg/ml組增殖抑制率依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與24 h相比，48 h與72 h細胞增殖抑制率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同一濃度下48 h與72 h間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同濃度丙泊酚對JEG-3細胞增殖抑制率的影響

2.2 不同濃度丙泊酚對滋養(yǎng)細胞侵襲、遷移的影響 與對照組比較，丙泊酚1 μg/ml組、丙泊酚4 μg/ml組、丙泊酚 7 μg/ml組侵襲、遷移細胞數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與丙泊酚1 μg/ml組比較，丙泊酚4 μg/ml組、丙泊酚7 μg/ml組侵襲遷移細胞數(shù)顯著下降(P<0.05)；與丙泊酚4 μg/ml組比較，丙泊酚7 μg/ml組侵襲遷移細胞數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1,表2。

對照組 丙泊酚1 μg/ml組 丙泊酚4 μg/ml組 丙泊酚7 μg/ml組

表2 Transwell實驗檢測丙泊酚對細胞侵襲、遷移能力的影響 n=6,個，

2.3 不同濃度丙泊酚對增殖、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達影響 與對照組比較，丙泊酚處理各組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與丙泊酚1 μg/ml處理組比較，丙泊酚4 μg/ml、丙泊酚7 μg/ml處理組的PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與丙泊酚4 μg/ml處理組比較，丙泊酚7 μg/ml處理組的PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,表3。

對照組 丙泊酚1 μg/ml組 丙泊酚4 μg/ml組 丙泊酚7 μg/ml組

表3 丙泊酚對PCNA、MMP-2、MMP-9及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達影響

2.4 PI3K/Akt通路抑制劑對JEG-3細胞增殖、侵襲遷移的影響 與對照組比較，抑制劑組、丙泊酚組、丙泊酚+抑制劑組細胞增殖抑制率均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數(shù)均顯著減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與抑制劑組比較，丙泊酚組細胞抑制率、侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，丙泊酚+抑制劑組細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組細胞增殖抑制率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3,表4。

對照組 抑制劑組 丙泊酚7 μg/ml組 丙泊酚+抑制劑組

表4 PI3K/Akt通路抑制劑對A431細胞增殖、侵襲遷移的影響

2.5 PI3K/Akt通路抑制劑對JEG-3細胞增殖、侵襲遷移及PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達影響 與對照組比較，抑制劑組、丙泊酚組、丙泊酚+抑制劑組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與抑制劑組比較，丙泊酚組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，丙泊酚+抑制劑PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4,表5。

對照組 抑制劑組 丙泊酚7 μg/ml組 丙泊酚+抑制劑組

表5 PI3K/Akt通路抑制劑對JEG-3細胞增殖、侵襲遷移及PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達影響

3 討論

滋養(yǎng)細胞可向母體子宮壁內(nèi)浸潤，當(dāng)其生長的精確時空調(diào)控被打破，可形成滋養(yǎng)細胞腫瘤，促使胚胎由良性葡萄胎向侵蝕性葡萄胎、絨癌轉(zhuǎn)化，早期可經(jīng)血運傳播轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅女性健康。丙泊酚為烷基酸類短效靜脈麻醉藥物，在臨床中常用。研究顯示，丙泊酚對肝癌、胃癌等惡性腫瘤有抗腫瘤作用，但在滋養(yǎng)細胞腫瘤中研究較少，本研究通過探討丙泊酚對滋養(yǎng)細胞JEG-3增殖、侵襲遷移作用并探討可能機制，為滋養(yǎng)細胞腫瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。

臨床中，丙泊酚作為麻醉劑血漿濃度為3～8 μg/ml，根據(jù)文獻及預(yù)試驗結(jié)果[7]，本研究選取丙泊酚濃度分別為1、4、7 μg/ml。研究顯示，丙泊酚對多種惡性腫瘤細胞增殖具有明顯抑制作用，如胰腺癌、宮頸癌等[8,9]。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚作用JEG-3細胞48 h、72 h時，細胞增殖抑制率顯著升高，且隨丙泊酚劑量的增加(1、4、7 μg/ml)增殖抑制率升高，提示丙泊酚對抑制JEG-3細胞增殖具有一定抑制作用，同一濃度下處理48 h與72 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此，后續(xù)試驗選取丙泊酚處理48 h。PCNA與細胞DNA合成密切相關(guān)，在細胞增殖啟動上發(fā)揮重要作用，其異常高表達是腫瘤惡性增殖的標(biāo)志之一[10]。本研究中丙泊酚處理后，JEG-3細胞中PCNA蛋白表達隨丙泊酚濃度升高依次降低，提示丙泊酚可抑制滋養(yǎng)細胞惡性增殖。

有研究指出，臨床相關(guān)濃度的丙泊酚可減少人肺癌、前列腺癌細胞侵襲能力[11,12]。Xu等[13]研究顯示，丙泊酚處理可通過抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路激活，降低MMP-2/MMP-9蛋白表達，發(fā)揮抑制食管鱗狀細胞癌細胞ECA-109侵襲能力。本研究Transwell小室試驗顯示，隨丙泊酚劑量增加，侵襲、遷移細胞數(shù)依次降低，提示丙泊酚可抑制JEG-3細胞侵襲與遷移，且呈劑量依賴效應(yīng)。研究表明，MMP-2、MMP-9可降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞遷移、侵襲，是癌細胞重要侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控因子[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)在惡性葡萄胎組織中MMP-2、MMP-9陽性表達顯著高于良性葡萄胎患者，推測其可作為滋養(yǎng)細胞浸潤早期的診斷標(biāo)志物[17]。本研究結(jié)果顯示JEG-3細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達隨丙泊酚濃度升高而降低，提示丙泊酚可能通過影響MMP-2、MMP-9蛋白表達抑制細胞侵襲、遷移過程。

PI3K/Akt信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能調(diào)節(jié)，在許多惡性腫瘤中PI3K持續(xù)激活，促進惡性腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[18,19]。研究顯示，阻斷PI3K/Akt信號通路傳導(dǎo)可抑制滋養(yǎng)細胞腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移[20]。本研究中，經(jīng)丙泊酚處理后，JEG-3細胞中PI3K及Akt蛋白磷酸化水平呈劑量依賴性降低，提示丙泊酚可能抑制PI3K/Akt通路活化。添加PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與丙泊酚組相比增殖、侵襲遷移及相關(guān)蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示丙泊酚處理與添加通路抑制劑效果相當(dāng)，丙泊酚+抑制劑組JEG-3細胞增殖抑制率進一步升高、侵襲遷移細胞數(shù)進一步降低，PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著下降，進一步提示丙泊酚可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化發(fā)揮抑制JEG-3細胞增殖與侵襲遷移作用。

綜上所述，丙泊酚可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化，抑制滋養(yǎng)細胞JEG-3細胞增殖、侵襲遷移，為滋養(yǎng)細胞腫瘤的治療提供新的依據(jù)。但本研究也存在一定不足，滋養(yǎng)細胞惡性增殖過程十分復(fù)雜，PI3K/Akt可能僅為發(fā)揮作用的其中一個通路，有關(guān)丙泊酚抑制滋養(yǎng)細胞惡性增殖、侵襲相關(guān)機制有待進一步研究。