表沒(méi)食兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)腦出血大鼠腦組織氧化應(yīng)激和線粒體的影響

楊莉 趙冉冉 楊峰 韓金濤 祁曉芳 李和軍 張文忠

腦出血是我國(guó)常見(jiàn)的腦血管病，是由腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起出血的急危重癥，其致死率和致殘率高[1-3]。腦出血后將導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷，使腦功能進(jìn)一步受到損害，目前認(rèn)為，繼發(fā)性腦損傷的機(jī)制與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、凋亡等自身?yè)p傷過(guò)程相關(guān)[4，5]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基的生成和自身對(duì)自由基清除、修復(fù)能力之間的不平衡狀態(tài)。在腦出血后，血腫周?chē)窠?jīng)細(xì)胞凋亡，機(jī)體氧自由基生成增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，氧化應(yīng)激進(jìn)一步加重腦損傷，形成惡性循環(huán)，進(jìn)而影響神經(jīng)功能[6，7]。表沒(méi)食兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)，是我國(guó)傳統(tǒng)綠茶中的主要有效成分，目前已發(fā)現(xiàn)EGCG具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等多種生物功效[8]。EGCG通過(guò)直接作用于自由基、激活抗氧化酶活性、與金屬離子螯合等多種機(jī)制在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗氧化的保護(hù)作用。本研究通過(guò)建立腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，觀察EGCG對(duì)大鼠腦出血血腫周?chē)M織氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔雄性SD大鼠60只，體重280～300 g(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(SHAM 組)、0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組(ICH 組)和治療組(EGCG 組)，EGCG組給予腹腔注射EGCG 50 mg/kg，Sham組和ICH組給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，連續(xù)7 d。

1.2 腦出血模型制備 采用腦內(nèi)注入膠原酶法建立大鼠腦出血模型。3.6%水合氯醛以10 ml/kg劑量腹腔注射以麻醉大鼠。麻醉后SD大鼠呈固定于立體定位儀,呈俯臥位，四肢伸開(kāi)，剪去大鼠頭頂部毛發(fā)、碘伏和酒精消毒手術(shù)區(qū)域，切開(kāi)大鼠頭部皮膚。使用腦立體定位儀定位大鼠左側(cè)尾狀核區(qū)，在顱骨表面標(biāo)記出以前囟為中點(diǎn)向左側(cè)旁開(kāi)3.0 mm處，自標(biāo)記點(diǎn)使用動(dòng)物骨鉆鉆開(kāi)骨性結(jié)構(gòu)，不可損傷硬腦膜，調(diào)節(jié)定位儀后，垂直將微量進(jìn)樣器插入鉆孔中，進(jìn)針深度6.0 mm，此為左側(cè)尾狀核區(qū)，將0.5單位的膠原酶5 min注射完畢，并保留針10 min后緩慢拔出，以骨蠟封閉鉆孔處。消毒手術(shù)區(qū)域并縫合頭皮。假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，僅將針置入尾狀核，不注入膠原酶。麻醉蘇醒后，觀察大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，則為造模成功。

1.3 方法 腦出血模型制備成功48 h后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將3組大鼠隨機(jī)分為2個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只。

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分:使用國(guó)際公認(rèn)的大鼠卒中后神經(jīng)功能缺損標(biāo)準(zhǔn)，即改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分法(modified neurological severity score,mNSS)，評(píng)價(jià)各組大鼠神經(jīng)功能受損情況。評(píng)價(jià)內(nèi)容包括有平衡木實(shí)驗(yàn)、行走測(cè)試，感覺(jué)測(cè)試、反射缺失、反常運(yùn)動(dòng)和提尾反射?？偡譃?8分，分?jǐn)?shù)越高，提示大鼠神經(jīng)功能障礙越重，1～6分提示神經(jīng)功能輕度受損，7～12分為神經(jīng)功能中度受損，13～18分提示神經(jīng)功能中度受損[9]。

1.3.2 線粒體膜電位和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè):大鼠斷頭取腦，冰盤(pán)上快速分離取腦組織，并眼科剪將腦組織剪碎后，研磨腦組織，經(jīng)300目篩網(wǎng)過(guò)濾后，即可制備腦組織單細(xì)胞懸液，以4 000 r/min室溫下離心3 min，棄上清后分為2份，一份與JC-1工作液混合,37℃避光孵育20 min，進(jìn)行線粒體膜電位分析，另一份與DCFH-DA工作液混合，37℃避光孵育20 min后行腦組織ROS檢測(cè)。

1.4 SOD檢測(cè) 大鼠斷頭取腦后冰上迅速分離腦組織，存入液氮中，于-80℃保存?zhèn)溆?。用移液管取體積總量為組織重量的9倍冷0.9%氯化鈉溶液。2/3的冷0.9%氯化鈉溶液置于燒杯中，加入剪碎腦組織，然后倒入玻璃勻漿管，再將剩余的1/3冷生理鹽水沖洗燒杯中殘留的腦組織塊，一起放入勻漿管中進(jìn)行勻漿，勻漿器放在冰浴中研磨6～8 min，使組織達(dá)到勻漿化。離心機(jī)2 000 r/min離心8 min，取適量上清液進(jìn)行SOD檢測(cè)。SOD檢測(cè)利用分光光度儀法，在腦組織勻漿上清液中加入檢測(cè)工作液，混勻后37℃孵育20 min,并在560 nm測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 SHAM組大鼠無(wú)神經(jīng)功能缺損，與SHAM組比較，ICH組和EGCG組大鼠腦出血后mNSS評(píng)分明顯升高 (P<0.05)，與ICH組比較，EGCG組mNSS評(píng)分明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 EGCG對(duì)腦出血大鼠mNSS評(píng)分的影響 n=10,分,

2.2 腦組織線粒體膜電位的變化 與SHAM組相比，ICH組大鼠腦組織的線粒體膜電位顯著下降(P<0.01)，EGCG組與ICH組相比，線粒體膜電位明顯上升(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 腦組織中線粒體膜電位的變化

2.3 腦組織SOD和ROS水平的改變 與SHAM組相比，ICH組大鼠腦組織中的SOD水平明顯下降(P<0.01)；與ICH組相比，EGCG組大鼠腦組織中SOD水平明顯上升(P<0.01)。與SHAM組相比，ICH組大鼠腦組織中ROS水平明顯下降(P<0.01)；與ICH組相比,EGCG組ROS水平明顯上升(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 腦組織中SOD和ROS水平的改變

3 討論

腦出血是臨床常見(jiàn)的腦血管病，占腦卒中的15%，多數(shù)是由于高血壓導(dǎo)致的微血管瘤的破裂引起，具有高致病率、高致殘率、高致死率的特點(diǎn)，其發(fā)病率有逐漸上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡越來(lái)越年輕化[1,2]。臨床上腦出血的治療大多以手術(shù)、康復(fù)治療以及脫水降顱壓治療為主，但多數(shù)患者最終遺留神經(jīng)功能障礙[3]。

目前國(guó)際公認(rèn)的研究腦出血的模型包括有膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型和自體血注入形成腦出血模型等。Rosenberg等[9]在立體定位儀輔助下注入大鼠尾狀核含膠原酶的0.9%氯化鈉溶液2 ml，注入10 min后即發(fā)生腦血管外血液的滲出，出血點(diǎn)周?chē)[明顯。與人類(lèi)腦出血情況相似，充分模擬了人類(lèi)腦血腫急性擴(kuò)大的發(fā)病過(guò)程，該模型制備簡(jiǎn)單、快捷、重復(fù)性好。

腦出血發(fā)生后臨近腦組織受血腫壓迫，導(dǎo)致腦血流動(dòng)力學(xué)異常及腦血流的減少，而腦血流減少導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，氧自由基增加，促進(jìn)顱內(nèi)水腫，誘發(fā)炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)一步加重顱內(nèi)水腫，形成惡性循環(huán)，腦功能出現(xiàn)損傷[10]。機(jī)制保護(hù)腦組織，緩解腦出血后繼發(fā)的神經(jīng)功能損傷，對(duì)于腦出血患者生活治療的提升有重要的臨床意義[11,12]。探討ICH的氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等引起的繼發(fā)性損傷機(jī)制對(duì)此至關(guān)重要。是線粒體生成ATP過(guò)程中的副產(chǎn)物，線粒體的氧化磷酸化是H2O2、O2-等內(nèi)源性自由基主要來(lái)源。在生理情況下，ROS是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，ROS的生成和清除呈動(dòng)態(tài)平衡。然而在腦出血后，大量ROS快速生成，破壞了ROS生成和清除的平衡。過(guò)量ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)氧化，DNA損傷和線粒體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織的破壞[13]。此外，ROS能促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，星形膠質(zhì)細(xì)胞的壞死，BBB破壞，導(dǎo)致腦水腫加重[14]。線粒體是機(jī)體自由基的主要來(lái)源，同時(shí)也是自由基損傷的首要靶點(diǎn)[15]。細(xì)胞內(nèi)ROS生成的主要部位是在線粒體的CI和CⅢ。線粒體功能障礙時(shí)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激性損傷進(jìn)一步造成線粒體功能損傷，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激損傷形成惡性循環(huán)[16,17]，其中線粒體發(fā)揮了中心地位，因此線粒體保護(hù)和抗氧化策略可能成為治療腦出血的有效途徑。在腦出血后氧化和抗氧化機(jī)制的失衡誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致過(guò)量氧自由基的生成，氧化應(yīng)激是腦出血后繼發(fā)腦損傷的關(guān)鍵因素，緩解氧化應(yīng)激、保護(hù)線粒體功能、減少ROS的生成有利于減輕腦出血后的神經(jīng)功能損傷。

EGCG 是從我國(guó)綠茶中提取的一種多酚類(lèi)單體，綠茶兒茶素中含量最高的抗氧化組分，研究發(fā)現(xiàn)EGCG具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等藥理作用，對(duì)心腦血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用[18-21]。ECCG對(duì)腦出血是否有保護(hù)作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦出血模型中，腦組織中線粒體膜電位下降，ROS含量明顯升高，自由基清除劑SOD含量減少，表明在腦出血后，腦組織線粒體功能受損，氧化還原狀態(tài)失衡，腦組織中存在有氧化應(yīng)激損傷，這與之前的研究結(jié)果相一致，腹腔注射EGCG組大鼠腦組織中的ROS含量和線粒體膜電位下降均明顯緩解，SOD含量增加，表明在腦出血大鼠模型中，EGCG具有保護(hù)線粒體功能和減輕氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上所述，在腦內(nèi)注入膠原酶法建立大鼠腦出血模型中，EGCG對(duì)于腦組織中氧化應(yīng)激損傷和線粒體功能有一定的改善作用，綠茶提取物EGCG對(duì)腦出血的臨床治療可能有潛在價(jià)值。