PP2A調(diào)節(jié)mbk-2影響秀麗隱桿線蟲胚胎發(fā)育

翟佳佳 康平

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，C.elegans)結(jié)構(gòu)簡單、生長周期短、基因與人類基因具有高度同源性、易培養(yǎng)，是研究遺傳、基因組和分子網(wǎng)絡(luò)的重要模式。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)屬于絲/蘇氨酸磷酸酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞關(guān)鍵功能，如細(xì)胞周期、發(fā)育、代謝和凋亡中發(fā)揮重要作用。mbk-2是秀麗隱桿線蟲雙特異性Yak-1相關(guān)激酶家族中的兩種絲氨酸/蘇氨酸激酶之一。mbk-2在早期胚胎發(fā)育，特別是在單細(xì)胞胚胎的多個(gè)微管依賴過程中起重要作用，包括原核遷移、紡錘體定位、微管穩(wěn)定性和染色體分離[1]。大規(guī)模線蟲RNAi篩選發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)子pptr-1、pptr-2對(duì)mbk-2有調(diào)節(jié)作用。pptr-1和pptr-2可編碼PP2A的調(diào)節(jié)亞單位，對(duì)調(diào)節(jié)PP2A功能發(fā)揮重要作用。本研究采用秀麗隱桿線蟲mbk-2突變體觀察PP2A調(diào)節(jié)亞單位pptr-1和pptr-2對(duì)mbk-2的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究mbk-2在胚胎發(fā)育中的作用及調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 線蟲株系與菌株 野生型線蟲N2、mbk-2基因敲除型線蟲株系、大腸埃希菌OP50 購自美國秀麗線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center)。

1.2 主要儀器及試劑 氨芐青霉素(上海BBI，A610028);羧芐青霉素(美國Sigma，A6140);L4440質(zhì)粒(美國Addgene)。體式解剖顯微鏡(廈門Motic)；低溫高速離心機(jī)(德國eppendorf)；激光共聚焦成像系統(tǒng)(德國Leica)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 線蟲生長培養(yǎng):線蟲培養(yǎng)采用NGM培養(yǎng)基，稱取NaCl 3 g，瓊脂20 g，蛋白胨2.5 g，溶于975 ml雙蒸水，高壓滅菌。冷卻后，加入1 mol/L CaCl21 ml，5 mg/ml膽固醇1 ml，1 mol/L MgSO41 ml和1 mol/L KPO4緩沖液25 ml，混勻后導(dǎo)入細(xì)菌培養(yǎng)皿中。室溫放置2 d后，鋪上OP 50菌，室溫放置2 d后即可培養(yǎng)線蟲。

1.3.2 線蟲同步化:將線蟲常規(guī)培養(yǎng)在NGM培養(yǎng)基上，20℃生化培養(yǎng)箱中生長繁殖。用Bleach裂解液沖洗NGM培養(yǎng)基，震蕩，低速離心，吸取上清液，再加入S-basal溶液，震蕩，離心，吸取上清。重復(fù)2次加入后加入S-buffer溶液放進(jìn)入25℃生化恒溫箱中培養(yǎng)過夜。第2天離心，吸取上清，將剩余部分混勻后，涂抹在NGM培養(yǎng)基上．待NGM培養(yǎng)基中的線蟲進(jìn)入產(chǎn)卵期，將正處于產(chǎn)卵期的線蟲(母蟲)挑到NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵。2～3 h后將線蟲(母蟲)挑走殺死后，將NGM培養(yǎng)基放進(jìn)25℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。第二天觀察存活情況，發(fā)育至成蟲(L4期)后可用來進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 RNAi干擾試驗(yàn):RNAi細(xì)菌在含有50 g/L氨芐青霉素的LB溶液中于37℃振蕩過夜。將細(xì)菌溶液點(diǎn)在NGM瓊脂平板上(含有100 g/L氨芐青霉素、12.5 g/L四環(huán)素和1 mmol/L IPTG)，并在室溫下誘導(dǎo)細(xì)菌過夜。在20℃條件下，將同步化好的N2及mbk-2基因缺陷線蟲在NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至L4期，喂食RNAi細(xì)菌，分別含有沉默pprt-1和pprt-2基因的質(zhì)粒(沉默組)和L4440空載質(zhì)粒(對(duì)照組)。

1.3.4 孵化率測定:將大約50只線蟲放在裝有300 μl 細(xì)菌的RNAi平板上，并對(duì)它們進(jìn)行培養(yǎng)，直到它們長到L4期。然后將線蟲轉(zhuǎn)移到裝有30 μl RNAi細(xì)菌的新鮮瓊脂培養(yǎng)平板(每塊平板上有三只蠕蟲)，并將其孵育24 h。然后這些線蟲(新的成蟲)被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)RNAi平板上，24 h后移除。將平板上的子代培養(yǎng)24 h后，我們對(duì)幼蟲和未孵化的蟲卵數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 幼蟲發(fā)育分析:線蟲從L1階段喂食RNAi細(xì)菌，直到線蟲成年產(chǎn)卵前兩天。預(yù)先準(zhǔn)備約0.4 mm厚的瓊脂墊，并在使用前與M9溶液和蓋玻片一起放入溫控培養(yǎng)箱中孵育2 h。在蓋玻片上滴加的2 μl M9緩沖液，并在其中解剖8～10個(gè)只成蟲，用熔化的凡士林封片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 pprt基因沉默對(duì)N2線蟲孵化的影響 采用含pprt-1和pprt-2的RNAi細(xì)菌喂養(yǎng)線蟲，觀察抑制pprt對(duì)線蟲孵化率的影響，對(duì)照組采用含L4440質(zhì)粒的細(xì)菌喂養(yǎng)。結(jié)果顯示，抑制pptr-1后，線蟲無蟲卵死亡，所有蟲卵均孵化出幼蟲。而抑制pprt-2后，(39.7±1.53)的蟲卵死亡，其未孵化率為(5.83±0.23%)，顯著高于對(duì)照組N2和pprt-1干預(yù)組。見表1，圖1。

2.2 pprt-1和pprt-2基因沉默對(duì)mbk-2突變線蟲孵化的影響 采用pprt-1和pprt-2的RNAi細(xì)菌喂養(yǎng)mbk-2突變型線蟲。結(jié)果顯示，L4440質(zhì)粒喂養(yǎng)的N2對(duì)照組線蟲，無蟲卵死亡，與N2組相比，mbk-2突變會(huì)增加蟲卵的未孵化率，在(1.63±0.51%)。采用RNAi抑制pprt-1后，蟲卵死亡增加，未孵化率(3.73±0.12%)，顯著高于N2對(duì)照組和pprt-1 RNAi處理組。抑制pprt-2后，線蟲蟲卵的未孵化率達(dá)到(76.74±1.62%)，顯著高于N2對(duì)照組，mbk-2組，mbk-2+pprt-1處理組以及pprt-1RNAi處理組。見表1，圖1。

表1 線蟲蟲卵孵化率統(tǒng)計(jì)表

圖1 線蟲蟲卵孵化檢測

2.3 pprt-2基因沉默對(duì)mbk-2突變線蟲胚胎發(fā)育的影響 為研究pprt-2對(duì)mbk-2的調(diào)控作用，采用pprt-2 RNAi細(xì)菌喂養(yǎng)mbk-2突變線蟲。對(duì)胚胎發(fā)育表型的研究顯示，在單細(xì)胞階段，pprt-2 RNAi干預(yù)對(duì)胚胎發(fā)育不產(chǎn)生影響，原核遷移、紡錘體的建立和假裂溝的位置正常。而在雙細(xì)胞階段，則表現(xiàn)為明顯缺陷。AB和P1細(xì)胞的大小相差很大；當(dāng)與野生型相比時(shí)，AB細(xì)胞比P1細(xì)胞大得多，和/或在AB細(xì)胞和P1細(xì)胞中都可以看到多個(gè)細(xì)胞核。我們還觀察到?jīng)]有細(xì)胞核或細(xì)胞體的額外細(xì)胞的存在，這些細(xì)胞在許多情況下與其他細(xì)胞分離，然后融合回來。AB和P1紡錘體可能已經(jīng)消失，或者其中一個(gè)丟失，或者它們可能有定向缺陷。在一些胚胎中，P1細(xì)胞首先分裂，或者AB和P1同時(shí)分裂(四極分裂)。其他胚胎表現(xiàn)出極端的胞質(zhì)分裂缺陷，其中細(xì)胞之間或異常的細(xì)胞-細(xì)胞接觸之間沒有明顯的邊界?；蛘?，當(dāng)4個(gè)單元可以區(qū)分時(shí)，它們的大小可能有很大的不同，4個(gè)細(xì)胞有多個(gè)細(xì)胞核。大多數(shù)觀察到的缺陷類似于mbk-2功能的強(qiáng)烈喪失，表明pptr-2影響胚胎此階段的發(fā)育需要mbk-2參與。這種相互作用獨(dú)有的一種表型是P1細(xì)胞分裂的延遲。在ABa和ABp細(xì)胞的細(xì)胞核形成之后，就在這些細(xì)胞分裂之前，P1紡錘體仍然沒有建立。在相同條件下的兩個(gè)細(xì)胞階段，具有pptr-2對(duì)照的N2也顯示出野生型發(fā)育，這意味著所觀察到的缺陷不僅是pptr-2功能降低的產(chǎn)物，并且具有L4440對(duì)照胚胎的mbk-2除了存在胞質(zhì)體之外大多是正常的，胞質(zhì)體是沒有細(xì)胞核的額外空細(xì)胞。見表2，圖2。

表2 線蟲胚胎發(fā)育表型檢測

圖2 胚胎發(fā)育表型觀察

3 討論

對(duì)mbk-2(dd5)修飾物的大規(guī)模RNAi篩選中，發(fā)現(xiàn)了四種增強(qiáng)子(rsa-1、pptr-1、pptr-2和rsa-2)。rsa-1、pptr-1、pptr-2均編碼PP2A的調(diào)節(jié)亞單位，rsa-2與rsa-1形成復(fù)合物[1]。PP2A參與許多重要的細(xì)胞功能，包括細(xì)胞移動(dòng)性[2]、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)[3]、細(xì)胞周期控制[4]、細(xì)胞生長控制、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡[5]、信號(hào)通路和腫瘤抑制[6]。核心PP2A酶由支架亞單位A和催化亞單位C組成，兩者都是高度保守的[7]。PP2A底物特異性是由幾個(gè)調(diào)節(jié)亞單位之一賦予的，它與核心酶相互作用形成全酶[2]。這些調(diào)節(jié)亞單位分為四個(gè)家族:B (B55或PR55)、B (B56或PR61)、B (PR48/PR72/PR130)和B (PR93/PR110)[2]。在秀麗隱桿線蟲中，已經(jīng)通過矯形學(xué)鑒定了7個(gè)PP2A調(diào)節(jié)亞單位:sur-6，B家族；pptr-1和pptr-2，B族；F47B8.3，C06G1.5，rsa-1和T22D1.5，B族[8]。

PP2A調(diào)節(jié)亞單位PPTR-1是有絲分裂期間P-顆粒的穩(wěn)定性和不對(duì)稱分布所必需的[9]。在胚胎的前四個(gè)分裂階段，P顆粒的不對(duì)稱分布對(duì)于確定種系和區(qū)分種系與體細(xì)胞前體是很重要的。有絲分裂后，P顆粒在種系前體中保持穩(wěn)定，但在體細(xì)胞胚粒中，P顆粒蛋白逐漸降解，P顆粒核糖核酸迅速降解[9]。PPTR-1特別適用于磷顆粒的分離，但不適用于分離PAR-1/2、MEX-5。這些種質(zhì)成分從磷顆粒中自由分離。在pptr-1突變胚胎中，P顆粒和核糖核酸被平均分配到體細(xì)胞和種系卵裂球，但在這些細(xì)胞類型中表現(xiàn)不同。在體細(xì)胞胚中，P顆粒RNA迅速消失，P顆粒在2個(gè)細(xì)胞周期后聚集成顆粒，在原腸胚形成后消失。在種系卵裂球中，P顆粒穩(wěn)定并重新組裝成顆粒；只是每個(gè)部門的規(guī)模和數(shù)量都減少了[9]。本研究顯示，在單獨(dú)抑制線蟲pprt-1表達(dá)后，對(duì)蟲卵的孵化率并無影響，而聯(lián)合抑制pprt-1和mbk-2后，蟲卵的未孵化數(shù)量增加，提示pprt-1通過調(diào)劑mbk-2發(fā)揮對(duì)發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。

PPTR-1還通過PP2A調(diào)節(jié)秀麗新桿線蟲胰島素/IGF-1信號(hào)傳導(dǎo)(IIS)途徑，在幼蟲發(fā)育過程中的壽命調(diào)節(jié)、達(dá)烏爾滯育、代謝和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[8]。IIS在生命周期和dauer滯育控制中是必不可少的，并且涉及由幾個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶介導(dǎo)的磷酸化級(jí)聯(lián)。激酶將信號(hào)傳遞給胰島素樣受體DAF-2以激活PDK-1激酶，后者將信號(hào)傳遞給AKT-1、AKT-2和SGK-1[10,11]。這些激酶負(fù)調(diào)節(jié)叉頭轉(zhuǎn)錄因子-16[12]。需要PP2A活性來平衡這些激酶在胰島素抵抗途徑中的作用。PPTR-1直接抑制AKT-1的功能，這積極地促進(jìn)了DAF-16的核定位和活動(dòng)[8]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子DAF-16激活與壽命、應(yīng)激抗性、達(dá)斡爾族形成和脂肪儲(chǔ)存有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[8]。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pptr-2是調(diào)節(jié)mbk-2功能的最強(qiáng)的增強(qiáng)子。mbk-2的兩個(gè)主要功能是控制微管依賴過程和調(diào)節(jié)種系決定因素。為了研究由參與相互作用的兩個(gè)基因的功能喪失所產(chǎn)生的亞細(xì)胞表型，著重研究了pptr-2的作用。結(jié)果顯示，不論是單獨(dú)抑制pprt-2，或聯(lián)合抑制pprt-2和mbk-2，線蟲蟲卵的未孵化水平均顯著升高。特別是聯(lián)合抑制，蟲卵的未孵化率可達(dá)到76.745，提示pprt-2是調(diào)控mbk-2功能的主要增強(qiáng)子。從DIC結(jié)果來看，mbk-2和pptr-2的相互作用在單細(xì)胞階段沒有表現(xiàn)出明顯的缺陷，這意味著這種相互作用在單細(xì)胞階段沒有影響原核的遷移、紡錘體的建立或假分裂的位置。在兩細(xì)胞階段，mbk-2和pptr-2相互作用涉及顯示強(qiáng)烈缺陷的胚胎，這與mbk-2功能的喪失非常相似。例如:極體出現(xiàn)在后部，多核，胞質(zhì)存在，紡錘體和胞質(zhì)分裂缺陷。這些可能表明pptr-2增強(qiáng)子與mbk-2在相同的過程中起作用，這可能是與后驗(yàn)決定子分布相同的過程。P-顆粒、OMA-1、PIE-1、POS-1和其他后向決定因素的分布需要mbk-2[13]。第一次細(xì)胞分裂后，mbk-2磷酸化OMA-1使其降解。通過將MEX-5/6分布到前部，mbk-2不對(duì)稱地定位了P-顆粒、PIE-1和位置-1[9,14]。因?yàn)镻PTR-1和PPTR-2在PP2A的相同亞基調(diào)節(jié)家族中。PPTR-1對(duì)有絲分裂過程中P顆粒的穩(wěn)定性和不對(duì)稱分布很重要[9,14]。PPTR-2也可能影響P顆粒和其他后決定因素。交互排斥表型，P1細(xì)胞的分裂比野生型延遲得多。這種表型先前被描述為在DNA檢查點(diǎn)途徑中基因功能的喪失。這可能預(yù)示著mbk-2和pptr-2對(duì)于該途徑是重要的，并且是P1細(xì)胞分裂時(shí)間所必需的。