ALDH1和AQP-5蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及與病理學(xué)參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系

王秋 林川

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)作為常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，占肺癌的80%以上[1]。癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，也是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因之一[2,3]。隨著醫(yī)療科研水平的提高，更多研究證實(shí)，疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體相關(guān)蛋白指標(biāo)密切相關(guān)。乙醛脫氫酶1(ALDH1)是細(xì)胞內(nèi)一種參與乙醛氧化的溶質(zhì)酶，在多種基因的表達(dá)、組織分化及干細(xì)胞早期分化中發(fā)揮重要作用[4]。研究表明，ALDH1在多種腫瘤細(xì)胞中呈表達(dá)上調(diào)且影響患者預(yù)后[5,6]。水通道蛋白(AQPs)是存在于具有分泌和吸收功能的上皮細(xì)胞中能夠轉(zhuǎn)運(yùn)水的特異孔道，哺乳動(dòng)物中包含多種亞型，其中AQP-5被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥組織中高表達(dá)，與淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)[7,8]。因此本研究擬分析ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)，并探討其與臨床病理學(xué)參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2013年12月我院手術(shù)切除的160例經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為NSCLC患者的組織標(biāo)本及其癌旁正常組織標(biāo)本。所有入選患者在術(shù)前未進(jìn)行放化療和其他治療且3年隨訪資料完整。160例NSCLC患者，男104例，女56例；年齡25～83歲，平均年齡(48.32±12.23)歲；參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)2009版[9]：Ⅰ期患者20例，Ⅱ期患者58例，Ⅲ期患者78例，Ⅳ期患者4例；腫瘤直徑<2 cm 完整70例，≥12 cm 90例；病理類(lèi)型：腺癌64例，鱗癌96例；組織學(xué)分級(jí)：高分化患者16例，中分化患者120例，低分化患者24例；共有98例發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有組織標(biāo)本在4%中性甲醛中固定，然后常規(guī)取材石蠟包埋，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。

1.2 抗體與試劑盒 兔抗人ALDH1多克隆抗體、兔抗人AQP-5單克隆抗體購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自上海滬峰化工有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒采購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)ALDH1、AQP-5蛋白表達(dá) 將收集的組織樣本固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行修復(fù)，以充分暴露抗原決定簇。然后用3%的H2O2溶液室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4℃過(guò)夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量DAB作用2～5 min后用去離子水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1.5～2 min，清洗后于梯度乙醇中脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹(shù)膠封片，鏡檢觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 病理切片陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn) 由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對(duì)病理切片進(jìn)行盲評(píng)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)在光鏡下觀察，用陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例來(lái)判定染色結(jié)果[10]。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)顯色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以染色細(xì)胞的陽(yáng)性比例評(píng)分<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述2項(xiàng)積分相乘，積分0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 隨訪 采用定期復(fù)查和電話相結(jié)合的方式，總生存時(shí)間(OS)為從手術(shù)至隨訪結(jié)束或者死亡時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，ALDH1、AQP-5在NSCLC組織和正常組織中表達(dá)的差異性及在腺癌與鱗癌、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移組間差異性用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)；在組織病理分級(jí)、臨床TNM分期組間表達(dá)的差異性用KruskalWallis H檢驗(yàn)；等級(jí)變量之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；Kaplan-Meier分析ALDH1、AQP-5蛋白與NSCLC患者生存率之間的相關(guān)性；Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析預(yù)后影響因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(dá) ALDH1、AQP-5蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中，ALDH1在NSCLC組織和癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.00%和25.00%，AQP-5在NSCLC組織和癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為93.75%和17.50%，NSCLC組織中ALDH1和AQP-5陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(P<0.001)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(dá) n=160，例

圖1 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)(×400)

2.2 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.538，P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性 例

2.3 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC臨床病理分組中表達(dá)的差異 ALDH1、AQP-5蛋白表達(dá)在腺癌和鱗癌間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 ALDH1、AQP-5蛋白在NSCLC臨床病理分組中表達(dá)的差異 例

2.4 ALDH1、AQP-5蛋白表達(dá)與NSCLC患者生存分析 84例ALDH1表達(dá)強(qiáng)度為++/+++的NSCLC患者，中位生存時(shí)間為18.5個(gè)月，76例CDK4表達(dá)強(qiáng)度為-/+的NSCLC患者，中位生存時(shí)間為39.4個(gè)月，ALDH1表達(dá)強(qiáng)度為-/+的NSCLC患者較表達(dá)強(qiáng)度為++/+++的NSCLC患者的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0018)；72例AQP-5表達(dá)強(qiáng)度為-/+的NSCLC患者，中位生存時(shí)間為40.5個(gè)月，88例AQP-5表達(dá)強(qiáng)度為++/+++的NSCLC患者，中位生存時(shí)間為21.7個(gè)月，AQP-5表達(dá)強(qiáng)度為-/+的NSCLC患者較表達(dá)強(qiáng)度為-/+的NSCLC患者的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0224)。見(jiàn)圖2。

圖2 ALDH1、AQP-5蛋白表達(dá)與NSCLC患者生存分析

2.5 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響NSCLC臨床預(yù)后的因素 單因素回歸分析顯示：分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及ALDH1與AQP-5的表達(dá)是影響NSCLC臨床預(yù)后的因素(P<0.05)；對(duì)以上影響NSCLC預(yù)后的因素進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果顯示TNM分期、ALDH1和AQP-5表達(dá)是影響NSCLC預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響NSCLC臨床預(yù)后的因素

3 討論

肺癌是臨床最為常見(jiàn)的腫瘤之一，由于發(fā)病比較隱匿，在早期并沒(méi)有特殊的癥狀，所以確診時(shí)一般多屬中期或者晚期，已經(jīng)不能進(jìn)行手術(shù)切除或者局部放療，且其預(yù)后較差[11]，給患者的家庭和社會(huì)均帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，因此尋找新的腫瘤標(biāo)志物，及早診斷及早治療成為科研工作者探尋的熱點(diǎn)。

ALDH1在人類(lèi)細(xì)胞表達(dá)于胞質(zhì)中，基因位于9q21 染色體上，是ALDH 家族成員之一。ALDH溶質(zhì)酶在代謝過(guò)程中能將醛類(lèi)氧化為相應(yīng)的羧酸從而解除機(jī)體毒素，主要底物視黃醛在ALDH的催化下可以氧化為維甲酸以調(diào)控基因表達(dá)及細(xì)胞分化。ALDH1蛋白近年來(lái)已陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)可作為多種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，如胰腺癌、乳腺癌、胃癌及卵巢癌等[12,13]。本研究結(jié)果顯示ALDH1在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為90.00%，明顯高于癌旁正常組織，提示ALDH1有望作為腫瘤標(biāo)志物為NSCLC的診治提供指導(dǎo)。另外ALDH1的陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC的分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明ALDH1表達(dá)呈陽(yáng)性的患者，分化程度低，TNM分期高且易于轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)NSCLC病程進(jìn)展，使腫瘤惡性程度高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)。AQP-5廣泛分布于多種細(xì)胞中，該基因在人類(lèi)位于12q3染色體上，AQP-5蛋白分子量大小21～24，其作用主要是轉(zhuǎn)運(yùn)水分子，維持機(jī)體水分平衡并參與調(diào)節(jié)生理活動(dòng)。AQP-5的高豐度表達(dá)在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)增殖抑制凋亡[14]。研究表明AQP-5與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在結(jié)腸癌和直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織[15]，本研究結(jié)果顯示AQP-5蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中，癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織，在分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即AQP-5表達(dá)與分化程度呈負(fù)相關(guān)，而與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示AQP-5高表達(dá)和NSCLC細(xì)胞侵襲、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差等特點(diǎn)相關(guān)，可以作為評(píng)價(jià)NSCLC發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)ALDH1和AQP-5在NSCLC組織中呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步的說(shuō)明ALDH1過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖，也可作為評(píng)價(jià)NSCLC發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。生存分析結(jié)果顯示ALDH1和AQP-5表達(dá)強(qiáng)度為-/+的NSCLC患者中位生存期較表達(dá)強(qiáng)度為++/+++的患者明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示ALDH1和AQP-5過(guò)表達(dá)均能明顯降低NSCLC患者的生存期，Cox分析結(jié)果顯示ALDH1和AQP-5均是影響NSCLC預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因子，提示ALDH1和AQP-5會(huì)促進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，ALDH1和AQP-5過(guò)表達(dá)可促進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展，降低NSCLC患者的生存期，聯(lián)合監(jiān)測(cè)ALDH1和AQP-5的表達(dá)對(duì)NSCLC的發(fā)生發(fā)展有一定的臨床價(jià)值。