HSP70對HepG2 2.15細胞HBV表達及Notch1信號通路的影響

榮海燕 蔣靜 時瑛 薛黎

近年來，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)在病毒復制領域的相關研究成為一個熱點內容。HSP是一類普遍存在于真核和原核生物中的由應激誘導的保護細胞免受各種環(huán)境損害的高度保守蛋白質，根據其分子量的大小可分為6個家族：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP、泛素[1]。其中分子量為70 kD 的熱休克蛋白HSP70 在原核和真核生物體內可通過參與一些重要蛋白質的轉位、折疊和裝配，進一步影響蛋白質功能的完整性，被稱為主要熱休克蛋白[2,3]。研究表明，HSP70 是細胞內分子伴侶和折疊蛋白系統(tǒng)的核心“組件”，在一些病毒的復制起始、轉錄翻譯和病毒粒子的裝配過程中都有HSP70的參與，其作用機制可能是通過其“分子伴侶”特性，與病毒自身的某些重要蛋白發(fā)生結合，影響這些蛋白的空間構象，從而參與病毒生命周期的各個階段，如轉錄、翻譯、復制及組裝[4,5]。Notch 信號通路是一種進化保守的信號通路，從果蠅到哺乳動物等許多生命體中普遍存在，在細胞的發(fā)育、分化、增殖、凋亡和調節(jié)組織內穩(wěn)態(tài)及腫瘤形成中具有重要的作用。在哺乳動物中存在4 種Notch 受體(Notch1～4)和5 種Notch 配體，Notch 信號通路參與了多種疾病(包括惡性腫瘤)的發(fā)生、發(fā)展過程[6,7]，其中，Notch1 信號通路是目前研究最多的信號通路之一。近年來Notch1 信號通路與肝癌的相關性研究備受關注。在HBV與Notch1 信號通路交互作用方面，研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X 蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)可能是通過NF-κB 和Notch1 途徑激活白介素-7受體(IL-7R)表達，進而促進乙肝病毒相關肝癌細胞的增殖和遷移[8]。由于病毒本身的復制能力有限，在很大程度上需要宿主蛋白來幫助其完成復制周期，為研究宿主蛋白HSP70 與HBV 復制的關系，本研究通過在HepG2 2.15 HBV復制細胞系中過表達HSP70來探討HSP70對HBV表達及Notch1信號通路的影響，旨在為HBV相關肝細胞癌的基礎研究、新藥開發(fā)和臨床診療等提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2 2.15人肝癌細胞株來源于豐暉生物；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(Invitrogen)；TransDetect Cell Counting Kit (CCK) (全式金生物)；pENTER空載質粒(Vigene)；Anti-HSP70 Antibody、Anti-HES1 Antibody(博士德)；Anti-Notch1抗體(abcam)；HBV核酸測定試劑盒(達安基因)；人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)(華美生物)；Real Time PCR instrument(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：HepG2 2.15細胞復蘇后用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 U/ml鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉染前1 d行HepG2 2.15細胞傳代，并以5×104/ml接種于6孔板。取生長狀態(tài)良好匯合率達90%的HepG2 2.15細胞，用完全培養(yǎng)基制備成5×104cells/ml單細胞懸液，每隔24 h接種至96孔板中(100 μl/孔，5個復孔，即5×103cells/孔)。8 d后小心吸干凈細胞培養(yǎng)基，每孔加入100 μl配置好的10% CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中37℃孵育，1 h后酶標儀450 nm波長檢測OD值。繪制生長曲線，確定細胞株的對數(shù)生長期，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 HSP70過表達質粒構建：由烏魯木齊歐易生物化學合成pENTER-HSPA4質粒，質粒送新疆昆泰銳生物測序，經分析合成序列與HSPA4參比序列一致。取生長狀態(tài)良好匯合率達90%的HepG2 2.15細胞，胰酶消化細胞后，用無抗生素的培養(yǎng)基制備成5×104cells/ml單細胞懸液，接種至24孔板中，500 μl/孔，置37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取3個2ml EP管設為A管、B管和C管，向A管中加入25 μl 無血清、無抗生素的培養(yǎng)基和0.75 μl Lipofectamine? 3000試劑，輕輕混勻。向B管中加入25 μl 無血清、無抗生素的培養(yǎng)基和1.5 μl LipofectamineTM3000試劑，輕輕混勻。向C管中加入50 μl的無血清無抗生素的培養(yǎng)基、1 μg PIRES2-ZSGreen1質粒、2 μl P3000TM試劑，柔和混勻。分別從C管中吸取25 μl置于A管、B管中，輕柔混勻，室溫放置10 min。將混合后的DNA/lipofectamine復合物按50 μl/孔加到含有細胞的24孔培養(yǎng)板的孔中，輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板。置37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，進行轉染后的熒光拍照，確定最佳轉染條件。取空白對照組、轉染后的空載組和HSP70過表達組細胞，每組3重復，Western blot驗證HSP70過表達情況。

關于高表達的HSP70與肝癌細胞HBV表達的關系，有學者做了相關實驗，將外源性Hsp70導入穩(wěn)定表達HBV的2215細胞，使Hsp70基因高表達，結果使細胞內HBV復制增加了1.8倍；將特異性Hsp70 siRNA轉染2215細胞，HBV復制顯著降低，并且沒有細胞毒性[10]。但是也有研究顯示：HSP70可能通過抑制核心啟動子Cp的活性抑制HBV的復制[11]。本研究結果顯示：與空白對照組比較，HSP70過表達組HBsAg、HBeAg指標陽性表達顯著增加，且細胞上清液中HBV-DNA濃度顯著升高(P<0.05)。提示HSP70對HBV復制起促進作用。

關于HSP70與信號通路的關系，有報道，進入細胞外的HSP70能促進肝癌細胞的上皮細胞間質轉化，影響肝癌細胞的遷移和侵襲能力，細胞外HSP70通過激活TLR2 和TLR4，繼而激活細胞內的JNK1/2/ MAPK 信號通路從而促進肝癌細胞的增殖[12,13]。

1.2.3.2 ELISA檢測細胞上清液HBV肝炎抗原HBsAg、HbeAg的表達量:按1.2.3.1實驗分組進行轉染，每組7個重復，取3組HepG2 2.15細胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測HBsAg和HBeAg表達。

1.2.3.3 熒光定量PCR檢測細胞上清液HBV DNA載量:按1.2.3.1實驗分組進行轉染，每組5個重復，取3組HepG2 2.15細胞培養(yǎng)上清，按照HBV核酸測定試劑盒檢測上清液中HBV DNA載量。

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HSP70在肝癌細胞中，有時表現(xiàn)為促進HBV復制的作用，有時又表現(xiàn)為抑制HBV復制的作用。我們推測可能是肝癌細胞內含有很多信號通路，有的通路促進病毒復制，有的通路抑制病毒復制，HSP70通過激活不同的信號通路從而表現(xiàn)出不同的作用結果。

綜上所述,政策因素、參保方因素、醫(yī)療供方因素等是影響醫(yī)保住院費用的主要因素,針對影響因素采取有效措施可以改善醫(yī)?；颊咦≡嘿M用不合理現(xiàn)象。

1.2.3.1 實驗分組:①空白對照組：HepG2 2.15細胞不做任何處理，正常培養(yǎng)48 h。②空載組：轉染pENTER空載質粒，轉染試劑濃度1.5 μl/ml，轉染時間48 h。③HSP70過表達組：轉染HSP70過表達質粒，轉染試劑濃度1.5 μl/ml，轉染時間48 h。

2 結果

2.1 HSP70過表達對HepG2 2.15細胞HBsAg和HBeAg的影響 ELISA實驗結果表明：與空白對照組相比，空載組HBsAg、HBeAg表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空載組相比，HSP70過表達組HBsAg、HBeAg陽性表達顯著增加(P<0.05)。見表1、2。

表1 空白組和空載組 HepG2 2.15細胞上清中HBsAg 、HBeAg定性分析 例

表2 空載組和HSP70過表達組HepG2 2.15細胞上清中HBsAg 、HBeAg定性分析 例

如圖2所示，直角部分可以采用兩條Clothoid曲線A0和A1過渡，曲線A0和A1分別起始于點P0與P1，相遇于P，在起始點處與直線曲率相同為0，在點P兩條曲線曲率相同并且切線平行反向，這樣保證了整條運動軌跡曲率G2連續(xù)。

2.2 HSP70過表達對HepG2 2.15細胞HBV-DNA濃度的影響 RT-PCR實驗結果顯示：與空白對照組相比，空載組HBV-DNA濃度無改變(P>0.05)；與空載組相比，HSP70過表達后，細胞上清液中HBV-DNA濃度水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 HSP70過表達對HepG2 2.15細胞上清液中HBV-DNA濃度的影響

2.3 HSP70過表達對HepG2 2.15細胞Notch1通道蛋白水平的影響 Western blot實驗結果表明：與空白對照組相比，Hes1、Notch1蛋白濃度在HSP70過表達組顯著升高(P<0.05)；與空載組相比，Hes1、Notch1蛋白濃度在HSP70過表達組顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 HSP70過表達對HepG2 2.15細胞上清液中Hes1、Notch1蛋白濃度的影響

3 討論

HSP70在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著復雜而多樣的作用，有時其扮演的角色甚至是對立的。一方面可以活化免疫細胞，激活機體細胞免疫，促進殺傷腫瘤，另一方面又可能通過復雜的通路，提高腫瘤細胞的免疫逃逸能力，從而減少腫瘤殺傷。大多情況下，HSP70在腫瘤細胞內表達增多，有文獻推測：腫瘤的形成過程中，腫瘤細胞不斷增殖，合成代謝增強，需要大量的HSP調節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖過程，而腫瘤組織生長旺盛，其增生的血管存在相對供血不足，缺氧與應激的細胞環(huán)境也反過來誘導HSP的過度表達[9]。

1.2.3 過表達HSP70基因對HepG2 2.15細胞的影響

1.2.3.4 Western blot檢測Notch1、Hes1蛋白的表達量:按1.2.3.1實驗分組進行轉染，每組3個重復，取3組HepG2 2.15細胞培養(yǎng)上清，三去污裂解液收獲總蛋白，蛋白定量后經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。加入鼠抗人Notch1單克隆抗體(1∶1 000稀釋)；鼠抗人Hesl單克隆抗體(1∶1 000稀釋)；鼠抗人β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(1∶3 000稀釋)。加入HRP標記的兔抗鼠二抗(1∶2 000稀釋)。ECL曝光顯影，計算機掃描蛋白質條帶后進行灰度分析。將β-actin作為內參照，分別用Notch1/β-actin、Hesl/β-actin的比值來代表Notch1、Hesl蛋白的相對表達水平。

目前，進口鉀到貨量較低，庫存持續(xù)消耗，市場可售現(xiàn)貨偏緊；各方對鉀肥大合同漲價預期較強，報價有不同程度提高；但鉀肥實際需求仍無明顯起色，市場多以觀望為主。鹽湖提價后，市場進入新價格消化期，將繼續(xù)對鉀肥市場起到支撐作用；國際鉀肥市場仍呈現(xiàn)供應偏緊狀態(tài)，貿易商漲價意愿較強。預計短期內國內氯化鉀價格將保持高位堅挺、穩(wěn)中探漲態(tài)勢，重點關注國內鉀肥大合同談判情況。

本研究結果顯示：與空載組相比，Notch1信號通路蛋白Notch1、Hes1蛋白濃度在HSP70過表達組顯著升高(P<0.05)。提示HSP70可能通過激活細胞內的Notch1通路影響肝癌細胞的生物學行為。

(1)樹立“無障礙網絡教育”的理念。政府和教育者要加大對障礙人士的關注。目前在無障礙網絡教育這一塊的研究還相對稀有，這是不利于網絡課程全面化、全民化發(fā)展的。

Notch 信號通路可以通過上調Hes1 的表達而影響細胞的生理。Notch信號通路的功能與細胞的特定類型有關，在不同的胚胎、組織或腫瘤中發(fā)揮著不同的作用[14]。有研究報道，Notch信號通路抑制肝癌細胞增殖，Notch1 通過作用于不同的細胞調節(jié)因子，誘導細胞周期G0/G1 期阻滯，從而抑制肝癌細胞的增殖，同時Notch1通過改變p53/Bcl-2 平衡，促進肝癌細胞凋亡[15]。也有研究顯示：Notch信號通路促進肝癌的發(fā)展，患者肝癌組織中有Notch的核內異常表達，用siRNA 敲低Notch3 的mRNA 能增強肝癌細胞對化療藥物的敏感性[16]。

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綜上所述，HepG2 2.15細胞內HSP70過表達促進HBV復制，并且細胞內Notch1、Hes1蛋白濃度升高，為肝癌的分子機制、靶向治療提供了可能的思路，但是HBV復制的增加與Notch1信號通路之間的相互作用和相關的分子機制有待進一步研究。