3株石油降解菌鑒定與降解特性研究

張寶寶，余天飛，艾加敏，王 華，柳曉東，姜影影，鄧振山

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

石油是一種粘稠狀、深褐色的液體[1]，其成分復(fù)雜，主要成分為烴類、非烴類化合物以及少量的有機(jī)金屬化合物[2]。石油在開采加工的眾多環(huán)節(jié)中，難免會(huì)泄露到土壤中，影響植物生長(zhǎng)及微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞。石油具有高粘度、高黏著力的特性，并且具有疏水性，因此會(huì)與土壤粘連在一起，阻塞土?？椎?，影響土壤的透水、透氣能力，并且石油還會(huì)侵蝕土壤，導(dǎo)致土層物理性質(zhì)改變，使土壤鹽堿化、板結(jié)概率增大[3]。對(duì)石油污染土壤中生長(zhǎng)的植物研究發(fā)現(xiàn)，石油會(huì)附著在植物根系表面，形成黏膜，降低植物的根系呼吸、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和養(yǎng)分吸收，當(dāng)石油濃度較大時(shí)，會(huì)造成植物根系腐爛，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致植物死亡[4]。石油污染會(huì)引起土壤中的有機(jī)碳含量明顯增加，影響土壤中的微生物生長(zhǎng)和繁殖，導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)，對(duì)土壤中的微環(huán)境產(chǎn)生一定的破壞[5]。

目前處理石油污染的方法主要有物理、化學(xué)、生物修復(fù)法。物理法因其成本較高、處理不徹底等問題，目前未能普及應(yīng)用；化學(xué)法往往會(huì)造成二次污染，修復(fù)效果不理想[6]。生物法是近些年興起修復(fù)方法，主要有協(xié)同修復(fù)法、微生物降解法，其修復(fù)效果明顯，對(duì)環(huán)境干擾較小，已成為處理石油污染主要修復(fù)的方法。

細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類等各種類群中都發(fā)現(xiàn)具有石油降解能力的生物[7]。目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道能夠降解石油微生物主要有：假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)放線菌屬(Actinomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、鐮刀菌屬(Fusarium)和小球藻(Chlorellavulgaris)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無色桿菌屬(Achromatobacteria)[8]。

微生物降解石油主要在水-油界面進(jìn)行，表面活性劑可以將石油乳化為更小的顆粒，從而可以擴(kuò)大石油與微生物的接觸面積，提高石油降解效率[9]。生物表面活性劑是一種微生物在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的一種雙親性化合物，具有降低油脂表面張力、乳化油脂，增強(qiáng)微生物表面的疏水性等作用[10]，通過卷曲、增溶和洗脫三大作用，能夠擴(kuò)大石油與土壤微生物的接觸面積，提高菌株對(duì)石油的降解效率，并且生物表面活性劑可降解、綠色環(huán)保[11]。因此篩選出既能產(chǎn)生表面活性劑又能降解石油的微生物，是當(dāng)前微生物修復(fù)法關(guān)注的熱點(diǎn)[12]。

陜北地區(qū)位于黃土高原中心區(qū)域，生態(tài)環(huán)境十分脆弱，同時(shí)陜北地區(qū)也是國(guó)家重要能源化工基地，石油資源豐富，但同時(shí)石油污染嚴(yán)重，因此處理陜北地區(qū)石油污染需要采取一種高效、綠色環(huán)保的修復(fù)手段?；诖?，本研究對(duì)3株石油降解菌進(jìn)行鑒定，研究其降解特性，進(jìn)一步豐富石油降解菌菌種資源，為微生物修復(fù)石油污染應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原油、菌株及試劑

實(shí)驗(yàn)所用原油采自陜西寶塔區(qū)青化砭鎮(zhèn)(36°78′45″，109°57′63″，暖溫帶大陸季風(fēng)性氣候)。

試驗(yàn)菌株由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，由微生物實(shí)驗(yàn)室-80℃冷凍甘油管保存，試驗(yàn)菌株為3株，分別編號(hào)為HZ-01、HZ-02、HZ-03。

C2Cl4購(gòu)自南京化學(xué)股份有限公司，Na2SO4、NaOH、NaCl均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

(1)PYG培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏0.2 g，葡萄糖5.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.5，121℃滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基需另加入15.0 g-20.0 g瓊脂。

(2)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，NH4Cl 0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.02 g，KCl 0.1 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

(3)石油培養(yǎng)基：在無機(jī)培養(yǎng)基中加入1%(v/w)的原油，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器

AL204電子天平(梅特勒·托利多儀器有限公司)、T-960PCR儀(力康生物科技有限公司)、島津UV-1780紫外可見分光光度計(jì)(東莞瑞高電子科技有限公司)、Oil-480紅外分光測(cè)油儀(北京華夏科創(chuàng)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

將-80℃甘油管冷凍保藏的菌株，接種到PYG固體養(yǎng)基上，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落，接種到PYG培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，重復(fù)以上步驟3次，可得到純菌落，將得到純菌株，4℃保藏試管斜面中，作為種子菌種，供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 菌懸液制備

將種子菌種接種到PYG液體培養(yǎng)基中，160 r/min，30℃培養(yǎng)48 h，吸取OD600 1.5的發(fā)酵液10 mL，然后將發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min，離心5 min，重復(fù)3次，用生理鹽水反復(fù)沖洗3次，收集菌體，再用無菌水混合，吹打至懸浮液，可制得所需菌劑。

1.2.3 菌株的鑒定

(1)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

采用菌落PCR對(duì)3株菌進(jìn)行16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，將3株菌分別接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落置于規(guī)格為1.5 mL滅菌離心管中，加入5 μL溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH，1%SDS)，PCR儀95℃反應(yīng)5 min，當(dāng)溫度達(dá)到16℃時(shí)取出，加入無菌水至100 μL，顛倒混勻，吹打成懸浮液，擴(kuò)增菌株16S rDNA序列時(shí)，吸取2 μL為模板；擴(kuò)增16S rDNA序列引物為：

P15′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′

P65′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTGTTACGACTTCACCC-3′

PCR反應(yīng)體系(2×EsMasterMix(Dye)25 μL，P12 μL，P62 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL)和反應(yīng)條件(預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火54 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；終延伸72 ℃，3 min；循環(huán)數(shù)：30)均參照康為世紀(jì)公司所生產(chǎn)的2×EsMasterMix(Dye)所提供的體系和條件擴(kuò)增，部分條件稍有改動(dòng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，90 V水平電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照檢查擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，用軟件MEGA-X構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹，測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至GeneBank，申請(qǐng)菌株序列登錄號(hào)。

(2)菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)方法[13]對(duì)3株菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，選取革蘭氏染色、接觸酶、明膠液化、甲基紅試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)等。

1.2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線繪制

將菌劑接種到PYG液體培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取4 mL菌懸液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)為600 nm處吸光度，一直持續(xù)至50 h，每次重復(fù)3次，以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以平均吸收值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 菌株產(chǎn)表面活性劑檢測(cè)

柴油-蘇丹Ⅲ混合液制備：用電子天平準(zhǔn)確秤取蘇丹Ⅲ0.05 g，并溶于100 mL柴油中，濾紙過濾，除去雜質(zhì)，并于121℃滅菌25 min，供后期使用。將菌懸液分別接種到PYG液體培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，使用菌離心管分裝，10000 r/min離心5 min，去除沉淀，保存上清液，重復(fù)離心3次。取9 cm滅菌培養(yǎng)皿，加入15 mL去離子水，滴入200 μL柴油-蘇丹Ⅲ混合液，使其形成油膜，覆蓋在去離子水表面，待油膜穩(wěn)定后，用微量移液器吸取2 μL發(fā)酵上清液滴入油膜中心，測(cè)量排油圈直徑，以未接種培養(yǎng)基為空白對(duì)照[14]。

1.2.6 菌株抗逆性試驗(yàn)

(1)菌株pH試驗(yàn)

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值，起始pH值分別為：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，鹽度為2.0%，分裝至250 mL三角瓶，每個(gè)瓶中加入1 mL菌劑，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，以未接菌劑液體PYG液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，然后使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸收值，每個(gè)梯度重復(fù)3次。

(2)菌株鹽度試驗(yàn)

用NaCl調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的鹽度，起始鹽度分別為：0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%，pH為7.0，分裝至250 mL三角瓶中，每個(gè)瓶中加入1 mL菌劑，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h，以未接菌劑PYG液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，然后使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸收值，每個(gè)梯度重復(fù)3次。

1.2.7 石油降解率的測(cè)定

在石油培養(yǎng)基中分別加入OD600=1.0的菌懸液，30℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，隔5 d測(cè)量1次石油濃度，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以未加菌劑為空白對(duì)照。采用Oil-480型測(cè)油儀測(cè)量石油降解率，每個(gè)樣品用10 mL C2Cl4萃取3次，合并萃取液，將萃取液用烘干48 h Na2SO4吸收多余水分，然后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用C2Cl4定容至50 mL，測(cè)定其濃度。

1.2.8 室內(nèi)模擬修復(fù)

從延安大學(xué)文匯山采0.5 m處泥土，過100目篩子，分裝到20 cm×40 cm的塑料盒中，每個(gè)塑料盒中分別裝2.0 kg泥土，稱取20.0 g原油用100 mL石油醚溶解稀釋，將稀釋液與泥土充分?jǐn)嚢瑁蛊浠靹?，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干，使石油醚完全揮發(fā)，模擬石油污染的土壤。每個(gè)樣品中加入發(fā)酵液，每隔5 d測(cè)1次石油濃度，每次測(cè)量每個(gè)樣品取5樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)取10.0 g土壤，將5個(gè)樣點(diǎn)樣品泥土充分混勻，測(cè)量樣品中的石油濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

菌株的16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果在紫外凝膠系統(tǒng)拍照結(jié)果(圖1A)所示，結(jié)果顯示，3株菌株16S rDNA PCR序列擴(kuò)增產(chǎn)物的大小均為1500 bp左右，測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST比對(duì)，HZ-01與Bacilluscereus(KX242264.1)同源性為99.79%，HZ-02和HZ-03與Bacillushalotolerans(MF988692.1)同源性分別為99.86%和99.72%，使用MEGA軟件中N-J方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1B和C)。

圖1 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果(表1)，3株菌株經(jīng)革蘭氏染色，3株菌均為革蘭氏陽性菌，明膠液化、淀粉水解、接觸酶3株菌均為陽性。V.P和M.R試驗(yàn)HZ-01和HZ-02均為陰性，HZ-03為陽性；3株菌均能利用葡萄糖產(chǎn)酸，其中HZ-03還能利用乳糖。

結(jié)合菌株的生理生化特性，初步確定HZ-01屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，HZ-02、HZ-03屬于嗜鹽芽孢桿菌(Bacillushalotolerans)，根據(jù)結(jié)果構(gòu)建3株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。將其上傳至GenBank申請(qǐng)序列登錄號(hào)，分別為HZ-01：MT328556，HZ-02：MT328557，HZ-03：MT328558。

表1 石油降解菌生理生化指標(biāo)

2.2 菌株產(chǎn)表面活性劑結(jié)果

表面活性劑能夠?qū)⒃腿榛癁樾☆w粒，改變油滴表面張力，可以提高微生物降解石油效率。因此通過測(cè)定排油圈的大小，間接反映菌株產(chǎn)表面活性劑的能力，如圖2所示。試驗(yàn)表明，HZ-01產(chǎn)表面活性劑能力最強(qiáng)，三者排油圈直徑分別為：HZ-01為5.68 cm，HZ-02為4.50 cm，HZ-03為3.12 cm。

圖2 3株菌排油圈

2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線

通過搖瓶試驗(yàn)培養(yǎng)繪制了3株石油降解菌的生長(zhǎng)曲線(圖3)，在相同培養(yǎng)條件下，HZ-01菌株相對(duì)于HZ-02菌株和HZ-03菌株生長(zhǎng)較好，并且3株菌株均在4-36 h生長(zhǎng)速度較快時(shí)，在40 h時(shí)達(dá)到到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

圖3 石油降解菌生長(zhǎng)曲線

2.4 菌株抗逆性測(cè)試試驗(yàn)

2.4.1 菌株的pH試驗(yàn)結(jié)果

高酸堿的環(huán)境可以抑制微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，成為限制微生物的主要環(huán)境因素，合適的pH是菌株正常生長(zhǎng)的條件之一。菌株的pH試驗(yàn)如圖4所示，結(jié)果表明，HZ-01最適生長(zhǎng)pH為8.0，HZ-02和HZ-03最適生長(zhǎng)pH為7.0。3株菌的耐受范圍均為pH 4.0-pH 10.0，耐受范圍廣，可以適應(yīng)陜北地區(qū)大部分地區(qū)。

圖4 菌株的pH試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 菌株的鹽度試驗(yàn)

圖5 菌株的鹽度試驗(yàn)結(jié)果

合適的鹽度是菌株正常生長(zhǎng)的條件之一，3株菌株耐鹽度試鹽如圖5所示。3株菌株均能對(duì)高鹽度有較好的耐受性，HZ-02和HZ-03最適鹽度為2.0%，HZ-02可耐受鹽度為6.0%，HZ-03可耐受鹽度為5.0%，HZ-01可耐受鹽度為3.0%。細(xì)菌內(nèi)部是一個(gè)半封閉的生理環(huán)境，內(nèi)部環(huán)境需要與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，高鹽度可以導(dǎo)致滲透壓的改變，而滲透壓的改變會(huì)直接影響到菌株的生長(zhǎng)，甚至?xí)?dǎo)致菌株的死亡。

2.5 石油降解效率

不同菌株降解石油能力各有差異，3株石油降解菌的降解效率如圖6所示，在石油初始濃度為10000 mg/L的條件下，經(jīng)過30 d的處理，添加HZ-01、HZ-02和HZ-03的原油培養(yǎng)基中石油濃度(c)分別為2782.5 mg/L、5767.0 mg/L和3045.9 mg/L，石油降解率為72.18%、42.33%和69.54%。在修復(fù)的0-5 d內(nèi)，微生物處于適應(yīng)期，降解效效果不明顯；在5-20 d中，微生物適應(yīng)了培養(yǎng)基環(huán)境，菌體生長(zhǎng)旺盛，代謝效率高，石油降解效果明顯，培養(yǎng)基已由清亮變得渾濁，原油大部分被乳化；20 d后，受營(yíng)養(yǎng)底物含量和次生代謝產(chǎn)物的限制，菌體生長(zhǎng)速率減慢，代謝活動(dòng)受到相應(yīng)的抑制，石油降解率趨于平緩。

圖6 菌株石油降解效率測(cè)定結(jié)果

2.6 室內(nèi)模擬修復(fù)

室內(nèi)模擬修復(fù)結(jié)果如圖7所示，在初始石油濃度為10000 mg/kg模擬石油污染土壤，分別添加HZ-01、HZ-02和HZ-03，經(jīng)過30 d的室內(nèi)模擬修復(fù)，樣品中的石油濃度分別為3717.8 mg/kg、5047.9 mg/kg和4168.8 mg/kg，石油降解率為62.82%、49.52%和58.31%。與石油培養(yǎng)基測(cè)定石油降解率相比，土壤的微環(huán)境復(fù)雜，石油降解菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取依賴外源添加，室內(nèi)模擬修復(fù)中各菌株的降解石油能力均有所下降。

3 討論與結(jié)論

目前，微生物在環(huán)境修復(fù)中已有很多應(yīng)用，在處理石油污染方面有了很多的研究。石油降解菌株的篩選是石油污染微生物修復(fù)的基礎(chǔ)與前提，受到人們廣泛關(guān)注。本研究中從石油污染的土壤中分離的3株石油降解菌，HZ-01可耐受鹽度為3%，HZ-02和HZ-03可耐受鹽度分別為5%和6%，H-02和HZ-03具有很好的耐鹽性，3株菌pH耐受范圍為pH 4.0-pH 10.0，HZ-01、HZ-02和HZ-03可適應(yīng)陜北石油開采大多數(shù)區(qū)域。

采用柴油-蘇丹Ⅲ測(cè)量排油圈直徑，相比于用石蠟油測(cè)量，柴油黏度較小，形成的油膜穩(wěn)定，靈敏度高；HZ-01、HZ-02和HZ-03排油圈直徑分別為5.68 cm、4.50 cm和3.12 cm，石油降解率分別為72.18%、42.33%和69.54%。與李曉娜等[15]從石油污染的土壤中分離出能產(chǎn)表面活性劑的石油降解菌XB(Bacillussp.)，其排油圈直徑為3.6 cm，石油降解率為72.30%相比，HZ-01與XB降解性能基本持平，但在產(chǎn)表面活性劑方面，HZ-01優(yōu)于XB；本研究中采用Oil-480型紅外測(cè)油儀直接測(cè)出石油濃度，除了直接使用紅外測(cè)油儀法，大多數(shù)研究者都采用紫外法、重量法、色譜法等方法，不同的方法在應(yīng)用時(shí)也各有利弊，在選擇時(shí)，應(yīng)根據(jù)自己試驗(yàn)的目的，選擇出適合自己的方法[15]，使用紅外測(cè)油儀，高效、易操作，并且誤差較小[16]。受土壤微環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)底物的影響，與采用石油培養(yǎng)基測(cè)定菌株降解效率相比，室內(nèi)模擬修復(fù)中的各菌株的石油降解效率均有所下降。

然而，本研究?jī)H對(duì)菌株表面活性劑進(jìn)行初步研究，后期還應(yīng)對(duì)表面活性劑化學(xué)組成進(jìn)行定性和定量分析，以及菌株是否存在一些功能基因。如：?jiǎn)渭友趺?、雙加氧酶基因[17]進(jìn)行鑒定；還需要對(duì)菌株進(jìn)行油藏環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)，以評(píng)定其在真實(shí)環(huán)境中的降解效果。