白占濤,張曉婷,楊清湖,李盼欣,雷祎凡,劉 霞*,姜 鳴*
(1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;2.多肽資源藥物研究中心;3.延安市特色資源生物工程技術(shù)研究中心;4.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心,陜西 延安 716000)
離子通道一直被認(rèn)為最具挑戰(zhàn)前景的藥物靶點(diǎn),原因是:離子通道高通量篩選的技術(shù)困難;以結(jié)構(gòu)解析、狀態(tài)構(gòu)象為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì);實(shí)現(xiàn)亞型選擇性的挑戰(zhàn)。隨著高通量膜電位分析系統(tǒng)、冷凍電鏡等技術(shù)的發(fā)展,技術(shù)困難這一問題逐漸淡化。然而,結(jié)構(gòu)解析以及亞型選擇性依然是開發(fā)新型離子通道藥物的難點(diǎn)[1,2],其不同功能狀態(tài)對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)改變?nèi)孕枭钊胙芯俊?/p>
鈉通道是產(chǎn)生和傳播神經(jīng)沖動(dòng)的重要離子通道,是動(dòng)物多肽的靶通道之一。解析鈉通道電壓感受器動(dòng)力機(jī)制的功能基序,期待為開發(fā)鈉通道門控類阻滯劑提供新的思路和見解,為治療功能獲得性與缺失性突變類疾病提供途徑。鈉通道亞型(如Nav1.2、Nav1.4、Nav1.5和Nav1.7)的冷凍電鏡顆粒結(jié)構(gòu)顯示:每個(gè)亞型的電壓傳感器都能根據(jù)膜電壓的改變而變化[3]。此外,α亞基還與β亞基共同調(diào)節(jié)膜定位、電壓依賴性以及通道門控動(dòng)力學(xué)[4,5]。迄今,鈉通道特異性的動(dòng)物多肽PaurTx3(Phrixotoxin),Pn3a(μ-theraphotoxin-Pn3a)的NMR、晶體結(jié)構(gòu)以及AaH2,ProTx-II(Protoxin-II)的冷凍電鏡顆粒結(jié)構(gòu)均被報(bào)道。2013年以來(lái),冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析逐漸成為主流。
本文聚焦鈉通道與動(dòng)物多肽的功能性結(jié)合,以經(jīng)典動(dòng)物多肽蝎多肽AaH2、狼蛛多肽ProTx-II與Nav1.7互作的冷凍電鏡顆粒結(jié)構(gòu)為模板,探究多肽結(jié)合與鈉通道激活、失活相關(guān)的電壓感受器構(gòu)象變化,提出多肽與鈉通道互作的微結(jié)構(gòu)域、氨基酸基序和空間等電點(diǎn)效能模型,以期為新型鈉通道亞型特異性人工肽的設(shè)計(jì)和研制提供新思路。
鈉通道負(fù)責(zé)動(dòng)作電位的快速上升階段,在大多數(shù)興奮性細(xì)胞的電信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用[6,7]。鈉通道由1個(gè)α亞基和1個(gè)或多個(gè)β亞基組成。哺乳動(dòng)物的α亞基由4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(domainI-domainIV,DI-DIV)組成,每個(gè)同源結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)跨膜片段(S1-S6)。S1-S4組成電壓感受器結(jié)構(gòu)域(voltage-sensor domains,VSDs),以S4跨膜α螺旋RX(X)XR基序帶正電荷精氨酸的位移響應(yīng)膜電位變化。S5和S6組成離子電導(dǎo)孔結(jié)構(gòu)域(pore module,PM),以S4-S5連接的構(gòu)型重排牽拉S6而改變孔道孔徑,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)門控調(diào)節(jié)。各結(jié)構(gòu)域?qū)νǖ赖拈T控、藥理和離子選擇性不同,共同調(diào)控鈉通道特性。
哺乳動(dòng)物鈉通道有Nav1.1-Nav1.9及NavX共10個(gè)亞型,分布在不同的組織和亞細(xì)胞。不同亞型結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致不同的疾病。顏寧等在總結(jié)鈉通道亞型突變體與疾病的關(guān)系時(shí),1000多個(gè)對(duì)應(yīng)關(guān)系中,突變點(diǎn)的位置較多出現(xiàn)在S4、S5、S6、S4-S5連接上,而這些位置與鈉通道的動(dòng)力機(jī)制密切相關(guān)[8]。因此,基于靶通道和藥物結(jié)構(gòu)的新受體位點(diǎn)和互作新機(jī)制解析,仍將是鈉通道病診療和小分子化合物、多肽藥物設(shè)計(jì)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
動(dòng)物多肽作為靶向鈉通道的天然探針。鈉通道特異性調(diào)制劑一般可以分為兩類:一類是由小分子藥物介導(dǎo)的能直接阻斷鈉通道電導(dǎo)的孔阻滯劑,如,河豚毒素(TTX)、貝類毒素(STX)、芋螺多肽KIIIA等[9,10];另一類是通過捕獲鈉通道的電壓感受器結(jié)構(gòu)域的某個(gè)特定狀態(tài),從而改變其動(dòng)作電位的發(fā)放和傳播的門控調(diào)制類多肽,如,蝎多肽AaH2、狼蛛多肽ProTx-II、虎紋捕鳥蛛多肽HWTX-IV(Huwentoxin-IV)等[9,11]。也有少量同時(shí)改變門控并阻斷電導(dǎo)的多肽,如灰色迪格蛛多肽Dc1a通過結(jié)合NavPas的VSDII和孔結(jié)構(gòu)域共同誘導(dǎo)通道的激活[12]。雖然鈉通道亞型間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和氨基酸序列高度同源,針對(duì)亞型間電壓感受調(diào)制位點(diǎn)的差異性,門控調(diào)制類毒素仍將是開發(fā)新型鈉通道阻滯劑或調(diào)制劑的首選。
已經(jīng)應(yīng)用于臨床的抗癲癇藥物、I類抗心律失常藥和局部麻醉劑等藥物的作用位點(diǎn)是DIII和DIV的S6跨膜段形成的孔腔[5]。然而,動(dòng)物多肽與哺乳動(dòng)物鈉通道相互作用的較為精細(xì)的結(jié)構(gòu)機(jī)制研究鮮有報(bào)道。Catterall團(tuán)隊(duì)通過在細(xì)菌鈉通道NvAb的VS中引入二硫鍵交聯(lián)以及構(gòu)建電壓轉(zhuǎn)移突變體,成功捕獲鈉通道的靜息狀態(tài)[13]。顏寧、劉棟梁等在研究狼蛛多肽ProToxin-II結(jié)合hNaV1.7的結(jié)構(gòu)解析時(shí)提供了較為清晰的激活狀態(tài)構(gòu)象和失活狀態(tài)構(gòu)象。此外,該團(tuán)隊(duì)使用蝎多肽AaH2捕獲Nav1.7的去激活狀態(tài)。這些結(jié)構(gòu)解析凸顯了冷凍電鏡技術(shù)不可替代的優(yōu)勢(shì)。因此,本文擬以AaH2、Protoxin-II與Nav1.7互作的冷凍電鏡顆粒結(jié)構(gòu)為例,解析探究動(dòng)物多肽與鈉通道結(jié)合、構(gòu)象、功能調(diào)制的特異性。
多肽通過結(jié)合鈉通道的不同狀態(tài)改變其構(gòu)象。由于多肽三維結(jié)構(gòu)的不同折疊反映出的功能氨基酸的立體位置不同,多肽的表面凸起的功能性氨基酸中極性較大的氨基酸,作為結(jié)合鈉通道各亞型的關(guān)鍵氨基酸,以其特殊的立體結(jié)構(gòu)與自身的強(qiáng)極性,成為與鈉通道各亞型結(jié)合的選擇性因素。
相同門控功能的毒素具有相似的拓?fù)錁?gòu)象或表位兩相極性,狼蛛多肽ProTx-II、PaurTx3、CcoTx1(Ceratoxin)[14]、Pn3a[15]和Tp1a(m-TRTX-Tp1a)[16]多肽表面的極性氨基酸D或Y選擇性靶向結(jié)合Nav1.7的去極化進(jìn)而影響其門控特性。
AaH2和ProTx-II的核磁共振結(jié)構(gòu)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)這2種多肽都含有一部分疏水殘基(如W、F等),同時(shí)含有由高極性殘基(如K、R等)組成的結(jié)構(gòu)。誘變研究表明,AaH2中第62位R與第64位H單點(diǎn)突變會(huì)影響多肽與鈉通道結(jié)合的穩(wěn)定性與效能。AaH2結(jié)合鈉通道結(jié)構(gòu)域DIV時(shí),AaH2的第62位的R同時(shí)與S5螺旋上第265位的Q和S3-S4連接上第1589位的E共同作用,AaH2第64位的H與S5上第273位的H、第270位的D以及另外一個(gè)Q形成靜電作用[17]。Protoxin-II與NaV1.7靶向結(jié)合時(shí),貢獻(xiàn)較大的第22位的R與DIIS3-S4連接的第816位的D結(jié)合,第26位的K與DIIS3上的第811位的E結(jié)合[18]。劉中華等發(fā)現(xiàn),蜘蛛多肽Hptx1結(jié)合在Nav1.7DII的S3-S4片段,在S3-S4片段中第816的N和第818位的E與Hptx1特異性結(jié)合[19]。雖然這2種毒素作用于鈉通道的受體位點(diǎn)不同,結(jié)合通道的重要氨基酸存在細(xì)微差異,但是它們能通過相似的方式改變通道的構(gòu)象。
此外,深入分析其它多肽的功能氨基酸,發(fā)現(xiàn)這些動(dòng)物多肽(PaurTx3、GpTx-1、JzTx-V等)表面連續(xù)并且凸出的帶正電荷的氨基酸能特異性結(jié)合Nav1.7。序列對(duì)比結(jié)果顯示:這些多肽都有1個(gè)近距離間隔性排列的強(qiáng)極性氨基酸基序KX(X)XR(表1)。因此,多肽微結(jié)構(gòu)帶正電荷的極性氨基酸基序KX(X)XR是多肽與通道結(jié)合的重要因素,它能拮抗S4電壓感受器結(jié)構(gòu)域改變通道構(gòu)象。
表1 靶向結(jié)合Nav1.7的動(dòng)物多肽功能性氨基酸基序
鈉通道門控調(diào)制多肽主要結(jié)合位點(diǎn)為在VSDII和VSDIV。VSDII和VSDIV結(jié)合囊中的序列差異具有亞型選擇性。
表2 Nav通道亞型DII結(jié)構(gòu)域S3功能性氨基酸基序比對(duì)
Nav1.7VSDII的S3跨膜螺旋823位的F與826位的D是Protoxin-II特異性選擇的關(guān)鍵氨基酸[26]。Nav1.7F(823位)相對(duì)應(yīng)的G(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.8)、S(Nav1.6)、M(Nav1.9)和Nav1.7D(826位)相對(duì)應(yīng)的N(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4)、R(Nav1.5)、K(Nav1.8)、V(Nav1.9)(表2)特性表明:鈉通道亞型間特異性氨基酸基序是差異性識(shí)別多肽的關(guān)鍵性。因此,推測(cè)-FLAD-基序是Nav1.7DII受體位點(diǎn)結(jié)合多肽的主要基序之一。
電壓感受結(jié)構(gòu)域DIV的S2螺旋殘基中,不同亞型之間的序列差異(表3)很大,Y1537和W1538(YW)在決定亞型選擇性方面起著至關(guān)重要的作用。
表3 Nav通道亞型的DIV結(jié)構(gòu)域S2功能性氨基酸基序比對(duì)
芳基磺胺類抑制劑,如GX-936[27,28]和PF-04856264[29-31]在人類Nav1.7電壓感受結(jié)構(gòu)域DIV中的靶點(diǎn)是YW(Y1537/W1538)基序。在VDSIV中S2的這個(gè)位置上,只有Nav1.2、Nav1.6和Nav1.7這3個(gè)亞型存在YW基序。重要的是,芳基磺酰胺VSDIV結(jié)合位點(diǎn)上的其他殘基原則上可以用來(lái)制造更具選擇性的化合物,如Nav1.7DIV的V1541(S2),在Nav1.2、NaV1.4、Nav1.5、NaV1.6、Nav1.8、NaV1.9的同等位點(diǎn)氨基酸為L(zhǎng),ProTx-II不能結(jié)合Nav1.2、NaV1.4、Nav1.5,因?yàn)檫@些鈉通道亞型相應(yīng)位點(diǎn)沒有F。推測(cè)-VLYW-基序是Nav1.7DIV受體位點(diǎn)結(jié)合多肽的主要基序之一。
因此,基于多肽的KX(X)XR序列結(jié)合Nav1.7的-FLAD-基序或者-VLYW-基序,認(rèn)為鈉通道特異性功能氨基酸基序是靶向結(jié)合多肽的重要因素?;诖嗽碓O(shè)計(jì)亞型選擇性較高的阻滯劑相對(duì)簡(jiǎn)單,比如已經(jīng)報(bào)道的Nav1.7阻滯劑AMG8379[32,33]。
鈉通道在不同狀態(tài)下,位于細(xì)胞膜外側(cè)的結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出不同特點(diǎn),這些不同的結(jié)構(gòu)狀態(tài)提供了不同的結(jié)合位點(diǎn)。
Nav1.7處于靜息狀態(tài)時(shí),DII結(jié)構(gòu)域的S1-S2(764位-774位),S3-S4(829位、830位),S5-S6(884位-912位,936-946)位于細(xì)胞膜外側(cè)。在失活狀態(tài)時(shí),S3-S4結(jié)構(gòu)域向著胞內(nèi)的方向移動(dòng),使得S3螺旋上的氨基酸基序成為多肽的主要受體位點(diǎn),如ProTx-II能結(jié)合失活狀態(tài)下暴露在外的DIIS3螺旋上的-LFLAD-基序,同時(shí)也能結(jié)合激活狀態(tài)下DIV的S3。
處于激活狀態(tài)下,S3-S4連接上的氨基酸基序向外伸展,使電壓感應(yīng)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的電場(chǎng)環(huán)境外移,結(jié)合極性較強(qiáng)的氨基酸,位于S3上帶強(qiáng)極性的氨基酸以最快的方式結(jié)合多肽表面帶正電荷的R或者K,這也是多肽結(jié)合鈉通道激活狀態(tài)的常見方式。
多肽與鈉通道結(jié)合關(guān)系顯示,互作的氨基酸等電點(diǎn)之和多數(shù)為11-14范圍,多肽與通道結(jié)合時(shí)效能較強(qiáng)的重要位點(diǎn)互作關(guān)系中,等電點(diǎn)之和更靠近14[18,34]。
AaH2的62位等電點(diǎn)為10.76的R突變?yōu)榈入婞c(diǎn)為6.02的A,多肽的效能降低80倍,同時(shí)通過構(gòu)建AaH2的模擬體實(shí)驗(yàn)證明,帶強(qiáng)極性電荷的氨基酸是多肽結(jié)合鈉通道的重要功能氨基酸。因此,認(rèn)為ProTx-II結(jié)合Nav1.7的重要氨基酸K22和R26突變?yōu)锳時(shí),不能結(jié)合Nav1.7或者結(jié)合效能降低。同時(shí),靶向Nav1.7的多肽基序KX(X)XR的重要氨基酸發(fā)生突變,效能都會(huì)降低或者失敏。實(shí)驗(yàn)證明,ProTx-II 22位的R突變?yōu)闃O性相反的D和E,結(jié)合Nav1.7的效能降低300倍[18]。這也是將ProTx-II 22位的R突變?yōu)橄喾窗被岵皇鞘Ф切芙档偷暮侠斫忉尅?/p>
基于以上鈉通道多肽互作結(jié)合的氨基酸基序空間等電點(diǎn)效價(jià)關(guān)系,可以通過等電點(diǎn)原則與的關(guān)系去設(shè)計(jì)特異性人工肽,使得人工肽精準(zhǔn)調(diào)控狀態(tài)依賴性鈉通道。
強(qiáng)極性的氨基酸通過結(jié)合或者互斥使得電壓感受器結(jié)構(gòu)域電場(chǎng)位移變化達(dá)到13?左右(等同于2個(gè)強(qiáng)極性氨基酸的通過電場(chǎng)的距離)時(shí),表現(xiàn)出多肽對(duì)通道調(diào)控具有較強(qiáng)的效能。如,AaH2結(jié)合Nav1.7的VSDIV的失活狀態(tài)時(shí),通道構(gòu)象的S4螺旋下移13?[34];ProTx-II結(jié)合Nav1.7的VSDII時(shí),S4螺旋下移10?。AaH2和ProTx-II比其他多肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的效能。當(dāng)然,多肽的空間構(gòu)象作為影響因子參與其中,在鈉通道完全激活和完全失活的特定狀態(tài)下,結(jié)構(gòu)域之間的開窗是不變的,多肽表面可嵌入鈉通道開窗同時(shí)帶有功能氨基酸的空間構(gòu)象成為二者結(jié)合之后表現(xiàn)的效能差異的另一重要因素。
Jian Payandeh以及Alexis Rohou等在解析α蝎多肽AaH2時(shí)發(fā)現(xiàn),Nav1.7與VSDIV結(jié)合的嵌入面積(~712?2)比其與VSDI結(jié)合的嵌入面積(~432?2)大[18],嵌入面積間接影響了電壓感應(yīng)結(jié)構(gòu)域電場(chǎng)的改變。如在NaV1.5的PM中,抗心律失常藥物氟卡奈德可以通過DII和DIII之間的開窗進(jìn)入其結(jié)合位點(diǎn)[35,36],根據(jù)NaV1.4的分子建模研究,也可以通過其他窗口進(jìn)入,比如DIII-DIV。然而,DII-DIII開窗最大,但在rNaV1.5C中DII-DIV開窗明顯較小[37]。
基于多肽直接改變鈉通道電壓感受器結(jié)構(gòu)域空間位移,以及嵌入面積間接作用鈉通道電壓感受器結(jié)構(gòu)域的特性,結(jié)合二者之間的共同作用關(guān)系表明,電壓感受器結(jié)構(gòu)域內(nèi)的距離改變是多肽對(duì)鈉通道的作用速率快慢的重要因素。據(jù)此推測(cè),Huwentoxin-IV優(yōu)先結(jié)合Nav1.7的DII,效能卻弱于Protoxin-II。
靜息狀態(tài)下處于胞外的結(jié)構(gòu)域S1-S2螺旋上疏水性氨基酸基序(如I,A等)也是多肽的主要受體位點(diǎn)。多肽表面的親水性氨基酸(如T,Y,Q)能與之結(jié)合。如Nav1.7上的A(766位)和I(767位)與ProTx-II的T(8位)結(jié)合[18]。
孔阻滯劑與鈉通道結(jié)合的結(jié)構(gòu)解析較少,與其對(duì)鈉通道亞型選擇性相對(duì)較低有關(guān)。比如TTX與STX作為經(jīng)典的孔阻滯劑毒素,它們都能直接進(jìn)入鈉通道的孔結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湔{(diào)控[12]。這些小分子藥物與4個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合較為復(fù)雜,雖然作用效能很強(qiáng),但是由于鈉通道亞型孔結(jié)構(gòu)域強(qiáng)大的保守性,小分子藥物難以對(duì)其差異調(diào)控。但一些特殊的小分子多肽也能選擇性調(diào)控離子通道孔,比如μ-芋螺多肽KIIIA,其結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸以強(qiáng)極性帶負(fù)電荷的氨基酸為主,與STX和TTX相比,它能靶向結(jié)合Nav1.2,但是需要輔助性β2亞基的存在[10]。鈉通道的微結(jié)構(gòu)域很多,各自功能不同。鈉通道微結(jié)構(gòu)域與多肽的特異性關(guān)系豐富了多肽調(diào)控鈉通道亞型的差異性,同時(shí)為人工肽設(shè)計(jì)拓展了方向。
基于Nav1.7的微結(jié)構(gòu)-FLAD-基序或者-VLYW-與多肽的KX(X)XR序列的功能性結(jié)合特點(diǎn),可用于靶向性人工肽藥物設(shè)計(jì)與開發(fā)。如,Nav通道快速失活的先天性心臟病[38],可以選擇性靶向DIV結(jié)構(gòu)域的多肽藥物。相反,與Nav通道異常打開相關(guān)的癲癇疾病可以選擇DI、DII、DIII中的任意一個(gè)電壓感受器結(jié)構(gòu)域藥物加以調(diào)制[39,40]。此外,依據(jù)微結(jié)構(gòu)域功能性結(jié)合特點(diǎn),可根據(jù)鈉通道亞型差異和狀態(tài)差異下的微結(jié)構(gòu)域來(lái)設(shè)計(jì)選擇性靶向藥物,開發(fā)3D打印和計(jì)算模擬多肽藥物基序和空間設(shè)計(jì),并借助納米顆粒實(shí)現(xiàn)靶向鈉通道的多肽優(yōu)化支架。
結(jié)構(gòu)解析和藥理實(shí)驗(yàn)表明,AaH2和ProTx-II以強(qiáng)極性氨基酸特異性結(jié)合Nav1.7,等電點(diǎn)較大的互作關(guān)系中表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理學(xué)效能??臻g等電點(diǎn)改變鈉通道電壓感受器結(jié)構(gòu)域內(nèi)的電場(chǎng)位移,嵌入面積反映了多肽對(duì)鈉通道的作用速率。因而,多肽與鈉通道的互作關(guān)系背后暗含的微結(jié)構(gòu)域,可作為鈉通道特異性的功能口袋應(yīng)用到未來(lái)藥物的開發(fā),對(duì)功能性口袋的調(diào)控可以通過空間位移距離來(lái)差異調(diào)控,這些特性為設(shè)計(jì)人工肽提供了可行性。鈉通道和多肽互作的類似基序也許可能有很多,應(yīng)強(qiáng)化鈉通道與多肽的功能互作動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)解析,以實(shí)現(xiàn)鈉通道亞型選擇性多肽藥物的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)和調(diào)制。