泥蚶抗菌物質(zhì)的制備及其抗菌活性分析

劉 芳，陳慧玲，林宏宇

（寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100 ）

寧德二都盛產(chǎn)貝類，當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的泥蚶(Arca granosa) 因味道鮮美，被稱為“二都蚶”.泥蚶肉質(zhì)細(xì)嫩有彈性，因富含血紅蛋白，故肉色鮮紅，熱水焯燙30 s 后即可鮮食，也可酒漬后食用，或曬制成干品.泥蚶隸屬于軟體動(dòng)物門，具有藥用價(jià)值，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為泥蚶的殼具有消痰化瘀、制酸止痛的功效[1].研究表明，蚶肉中的蛋白質(zhì)類化合物是其主要的藥效成分[2]，其藥效作用主要有抗癌、抗腫瘤、抗疲勞等.姚如永等[3-4]從泥蚶中分離出了具有抗腫瘤作用的海生素，張永娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)泥蚶總蛋白具有抗疲勞作用，Ma 等[6]研究了抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）成為有效抗癌肽（anticancer peptides,ACP）的理化參數(shù).

抗生素濫用導(dǎo)致食品中抗生素殘留、超級(jí)細(xì)菌出現(xiàn)、人體耐藥性提高等多種問題，開發(fā)安全、高效的抗生素替代品顯得尤為重要，從生物體內(nèi)獲得天然的抗菌物質(zhì)則是一個(gè)重要的研究方向.目前發(fā)現(xiàn)的難以產(chǎn)生耐藥性、安全的抗生素替代品主要有抗菌肽、寡聚糖、益生菌等，其可用于食品、飼料、醫(yī)藥等多種產(chǎn)品中.蚶肉中含有豐富的蛋白質(zhì)和多肽，從蚶中分離出的活性蛋白及肽類已有約30 多種[2]，而目前關(guān)于泥蚶的抗菌肽研究較少.王素芳等[7]從泥蚶中分離純化出2 種血紅蛋白（Tg-HbⅠ和Tg-HbⅡ），且均對(duì)大腸桿菌和惡臭假單胞桿菌具有抗菌活性.王娟娟等[8]對(duì)泥蚶血紅蛋白酶解多肽的抗菌活性的研究結(jié)果表明，泥蚶多肽對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌具有明顯抗菌活性.柯佳穎等[9]通過研究泥蚶凝集素的抑菌作用表明，凝集素對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌活性.楊婷婷[10]對(duì)泥蚶血紅蛋白及其多肽的抗菌功能的試驗(yàn)結(jié)果表明，泥蚶血紅蛋白HbⅠ（血紅蛋白同源二聚體Ⅰ）、Hb II（血紅蛋白異源四聚體II）對(duì)大腸桿菌的MIC 分別為0.125 和0.375 mg·mL-1，對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC 分別為6.25×10-3和4.69×10-3mg·mL-1，說明泥蚶血紅蛋白及其酶解多肽均具有不同程度的體外抗菌活性.Samaneh 等[10]通過研究水解黃鰭金槍魚副產(chǎn)物所制得的抗菌肽的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)該抗菌肽對(duì)李斯特菌、葡萄球菌、大腸埃希菌和假單胞菌有一定的抗菌和抗氧化活性，并認(rèn)為該抗菌肽可在營(yíng)養(yǎng)保健品和功能性食品中用作抗菌和抗氧化劑成分.

以上研究表明，泥蚶中存在抗菌活性物質(zhì).因此，本研究以寧德二都地區(qū)盛產(chǎn)的泥蚶的軟組織為原料，通過酶解法制備抗菌物質(zhì)，研究其最佳酶解參數(shù)，旨在探索海洋生物資源新物質(zhì)，以期為推進(jìn)海洋生物制品新產(chǎn)品的研究與開發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

寧德二都泥蚶（購(gòu)于寧德新華都購(gòu)物廣場(chǎng)有限公司）、中性蛋白酶（Ruibio 公司）、大腸桿菌由寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院劉盛榮博士實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、B-400 型均質(zhì)機(jī)（瑞士步琦）、YB-FD-18 型冷凍干燥機(jī)（上海億倍實(shí)業(yè)有限公司）、SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）、DHP-9272A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海飛躍試驗(yàn)儀器有限公司）、麥?zhǔn)媳葷峁埽刂菘堤┥锟萍加邢薰荆┑?

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗菌物質(zhì)的制備工藝 將新鮮的泥蚶洗凈、吐凈泥沙后取軟組織，用75%酒精消毒，加入適量無(wú)菌水勻漿，用中性蛋白酶在適宜條件下酶解，酶解結(jié)束后，迅速在95 ℃下水浴滅酶10 min，然后置于4℃、4 000 r·min-1條件下離心30 min，取上清液，減壓濃縮，凍干，得泥蚶抗菌物質(zhì)凍干粉.

1.3.2 抗菌活性測(cè)定 采用比濁法測(cè)定抗菌活性[12-13].在3 個(gè)無(wú)菌三角瓶中分別加入25 mL 液體培養(yǎng)基，4 mL抗菌物質(zhì)液體，1 mL 菌懸液（菌濃度1×104CFU·mL-1），以不加抗菌物質(zhì)的三角瓶作為對(duì)照，充分混勻，將試管放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，用紫外-可見光分光光度計(jì)在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定培養(yǎng)液的吸光值.

1.3.3 單因素試驗(yàn) 采用單因素試驗(yàn)，以抗菌活性為指標(biāo)，研究酶解pH 值、溫度、時(shí)間、料液比對(duì)酶解法制備泥蚶抗菌物質(zhì)的影響.

pH 值的選擇：酶解時(shí)間為3 h，溫度50 ℃，料液比1∶5，酶添加量為6 000 U·g-1，設(shè)置pH 值梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，酶解后測(cè)定抗菌物質(zhì)的抗菌活性，每個(gè)水平重復(fù)3 次.

溫度的選擇：酶添加量為6 000 U·g-1，料液比為1∶5，溶液的pH 值為7.0，酶解時(shí)間為3 h.將酶解溫度設(shè)置為30、40、50、60、70 ℃5 個(gè)梯度，酶解后測(cè)定抗菌物質(zhì)抗菌活性，每個(gè)水平重復(fù)3 次.

時(shí)間的選擇：溫度為50 ℃，提取液的pH 值為7.0，料液比為1：5，酶添加量為6 000 U·g-1，設(shè)置時(shí)間梯度為1、2、3、4、5 h，酶解后測(cè)定抗菌物質(zhì)的抗菌活性，每個(gè)水平重復(fù)3 次.

料液比的選擇：溫度為50 ℃，pH 值為7.0，酶添加量為6 000 U·g-1，酶解時(shí)間3 h；設(shè)置料液比梯度為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，酶解后測(cè)定抗菌物質(zhì)的抗菌活性，每個(gè)水平重復(fù)3 次.

1.3.4 正交試驗(yàn) 為了進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件，在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上采用4 因素3 水平正交試驗(yàn)對(duì)酶解pH 值、溫度、時(shí)間、料液比條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳酶解條件.試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1.采用Minitab16 對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值對(duì)抗菌活性的影響

圖1 反應(yīng)了在不同pH 值環(huán)境下，中性蛋白酶作用于泥蚶軟組織后制備的抗菌物質(zhì)的抗菌活性.對(duì)照組的吸光值為0.731，試驗(yàn)組的吸光值均低于對(duì)照組，說明制備的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌具有抗菌活性.當(dāng)pH 值過低或過高，抗菌活性均相對(duì)較差，這可能是由于過低或過高的pH 值環(huán)境降低了酶的活性或者使酶失活，導(dǎo)致不能充分酶解泥蚶軟組織，無(wú)法釋放泥蚶蛋白質(zhì)中的活性肽段.當(dāng)pH 值為7.5 時(shí)OD600最低，抗菌活性最佳.

圖1 不同pH 值環(huán)境制備的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抗菌活性

2.2 溫度對(duì)抗菌活性的影響

溫度過高或過低均對(duì)酶活性有影響，而且過高的溫度會(huì)使酶變性失活，過低的溫度使酶解反應(yīng)速率過低，故合適的酶解溫度非常重要.由圖2 可知，試驗(yàn)組的吸光值均低于對(duì)照組，當(dāng)溫度在40～60 ℃范圍內(nèi)，多肽的抗菌活性均相對(duì)較高.當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，抗菌活性最佳.

圖2 不同酶解溫度制備的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抗菌活性

2.3 時(shí)間對(duì)抗菌活性的影響

由圖3 可知，酶解時(shí)間的長(zhǎng)短影響抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抗菌活性，當(dāng)酶解時(shí)間為3 h 時(shí)，抗菌活性最佳.時(shí)間短，酶和蛋白質(zhì)反應(yīng)不夠充分，無(wú)法充分釋放泥蚶組織中的抗菌物質(zhì)；時(shí)間過長(zhǎng)，泥蚶軟組織中的蛋白質(zhì)會(huì)被水解過度為氨基酸，因此有必要選擇合適的酶解時(shí)長(zhǎng).

2.4 料液比對(duì)抗菌活性的影響

料液比反應(yīng)了底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響，合適的底物濃度有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行.由圖4 可知，當(dāng)料液比為1∶5 至1∶7 時(shí)，抗菌活性較好；當(dāng)料液比為1∶6 時(shí)，抗菌活性最佳.

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)一步優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表2.根據(jù)表2 可知，從抗菌活性來(lái)看，4 個(gè)因素的影響主次順序?yàn)閜H 值＞溫度＞時(shí)間＞料液比.優(yōu)組合為A1B2C3D2，即pH 值為7.0，溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為4 h，料液比為1∶6.該組合不在正交試驗(yàn)表中，經(jīng)3 次驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果表明該組合的抗菌活性平均值為0.358，低于正交試驗(yàn)中不同酶解條件下制備的抗菌肽的抗菌活性.

圖3 不同酶解時(shí)間制備的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抗菌活性

圖4 不同料液比制備的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抗菌活性

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

抗菌肽廣泛存在于細(xì)菌、病毒和各種動(dòng)植物體內(nèi)，是一種具有抗菌活性的小分子肽[14].因其不易使微生物產(chǎn)生抗藥性、大部分對(duì)宿主無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)受到關(guān)注.但因從天然材料中提取抗菌肽工藝復(fù)雜、成本昂貴，化學(xué)合成成本高，基因工程表達(dá)載體構(gòu)建難，產(chǎn)量低等多種問題[15]，采用酶解法水解生物蛋白質(zhì)，釋放生物體內(nèi)蛋白質(zhì)中具有抗菌活性的肽段，成為人們常用的研究方法.本研究表明，泥蚶軟組織最佳酶解條件為pH 值7.0，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h，料液比1∶6，此條件下制備的抗菌肽具有一定的抗菌活性.相較于王素芳等[7]、王娟娟等[8]直接利用泥蚶的血液提取抗菌物質(zhì)，本研究不局限于泥蚶血液，而是采用了泥蚶的全部軟體組織，通過酶解法釋放蛋白質(zhì)中具有抗菌活性的多肽，可獲得抗菌物質(zhì)的范圍更廣.本研究重在初步探索海洋生物資源新物質(zhì)，有助于推進(jìn)海洋生物制品新產(chǎn)品的研究與開發(fā)，但尚處于探索階段，有待進(jìn)一步深入研究.