缺氧胃癌癌細(xì)胞衍生的外泌體轉(zhuǎn)移miR-143-5p促進(jìn)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移

劉 偉，胡永波，白少華，穆 磊，李 珊

1.長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院胃腸外科，湖北 仙桃 433000； 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸外科； 3.長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的癌癥之一，也是與癌癥相關(guān)的死亡的主要原因[1]。盡管臨床中標(biāo)準(zhǔn)的外科手術(shù)切除、化學(xué)療法、生物靶向治療等聯(lián)合輔助治療廣泛應(yīng)用，但不良預(yù)后和持續(xù)較高的死亡率仍然存在，其中很重要的原因是胃癌的早期轉(zhuǎn)移、侵襲性和對(duì)現(xiàn)有化療藥物耐藥等綜合因素所致[2]。因此，深入了解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤免疫抑制、轉(zhuǎn)移、化療耐藥發(fā)生中起關(guān)鍵作用，缺氧和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)的兩個(gè)主要因素[3-4]。氧氣壓力<5 mmHg的缺氧環(huán)境可在早期階段促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生化療藥物抵抗、放療抵抗和惡性進(jìn)展[4]。缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與調(diào)控癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)，上皮表型的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有更強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移力的間葉樣癌細(xì)胞[5]。

在腫瘤微環(huán)境的研究中，除了癌細(xì)胞分泌諸如細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的可溶性介體外，細(xì)胞間信息傳遞的介體還包括癌細(xì)胞外泌體。高侵襲性癌細(xì)胞外泌體可以攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和大量的非編碼RNA，其中以microRNA(miRNA)最多[6]。外泌體傳遞的miRNA可以調(diào)控受體細(xì)胞的靶基因，介導(dǎo)一系列病理生理變化，如促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、化療耐藥發(fā)生、腫瘤旁血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，以及通過(guò)重塑腫瘤微環(huán)境來(lái)支持癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。例如，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞釋放的外泌體傳遞miR-21增強(qiáng)了微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的M2樣極化，促進(jìn)了微環(huán)境的惡性化改變[8]。缺氧環(huán)境下胰腺癌細(xì)胞釋放的外泌體miR-103a通過(guò)誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤新生血管生成和血管通透性增加，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。相同的miRNAs可能在不同腫瘤中發(fā)揮截然相反的作用，本研究探討的miR-143-5p在前列腺癌、食管鱗癌中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-143-5p后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制和遷移受限[10]。而部分研究發(fā)現(xiàn)在胃癌[11]、骨肉瘤[12]中miR-143-5p的異常高表達(dá)參與缺氧誘導(dǎo)的腫瘤惡性進(jìn)展。miR-143-5p在不同腫瘤中截然相反的調(diào)控為我們的研究提供了思路，本研究中，我們探討了缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞外泌體釋放及外泌體介導(dǎo)的miR-143-5p癌細(xì)胞間傳遞調(diào)控及促癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑：Trizol試劑(Thermo Fisher，美國(guó))；BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR試劑盒(D7268M，碧云天生物技術(shù)公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，澳洲)；兔多克隆抗體CD81(Cell Signaling，美國(guó))，TSG101(Proteintech，美國(guó))，CD9(Abcam,美國(guó))，SMDT1(Invitrogen，美國(guó))、GAPDH(Santa Cruz，美國(guó))。兔多克隆抗體SMDT1(Abcam，美國(guó))；山羊抗兔IgG(H+L)抗體、ECL發(fā)光液(碧云天生物技術(shù)公司)；Matrigel基質(zhì)膠(Corning，美國(guó))；磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑，LY294002(440202，Calbiochem，英國(guó))最終藥物濃度為1 μmol/L[13]，GW4869通過(guò)美國(guó)MedChemExpress(HY-19363)購(gòu)買(mǎi)，最終使用濃度為10 mol/L[14]。miR-143-5p angomir和antagomir合成于武漢巴菲特生物技術(shù)公司。

1.1.2 儀器：細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Nexcelom Bioscience LLC，美國(guó))；紫外分光光度計(jì)(NanoDrop，美國(guó))；電子顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本，型號(hào)IX81)。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧處理：人胃癌細(xì)胞系HGC、AGS細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清(Gibco,美國(guó))。常氧條件為：37 ℃下在含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、20%的O2的常氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；缺氧條件為：37 ℃下在含體積分?jǐn)?shù)為1%的O2的缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外泌體分離和鑒定、PKH67熒光標(biāo)記：胃癌細(xì)胞AGS、HGC增殖為約50%接種密度后更換10%無(wú)外泌體血清(16141-061，Gibco，美國(guó))的DMEM培養(yǎng)基，并分別置于體積分?jǐn)?shù)為1% O2的缺氧培養(yǎng)箱、常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液以2 000g(r=12.25 cm,常溫)離心15 min和10 000g(r=8.19 cm, 4 ℃)離心30 min，以去除細(xì)胞碎片，然后以100 000g(r=7.18 cm,4 ℃)超速離心(日立超速離心機(jī)CP100NX)持續(xù)90 min。將沉淀的外泌體重懸于PBS中，儲(chǔ)存于-80 ℃。分離外泌體并將其加載到碳涂層電子顯微鏡格柵，進(jìn)行觀察記錄。純化的外泌體用PKH67標(biāo)記綠色熒光細(xì)胞接頭試劑盒(MINI67-1KT，Sigma-Aldrich，美國(guó))，根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行操作，PKH67標(biāo)記的外泌體被重懸并添加到常氧下胃癌AGS、HGC細(xì)胞。在37 ℃下孵育2 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察PHK67外泌體轉(zhuǎn)染情況。

1.2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)：根據(jù)Trizol RNA(Thermo Fisher，美國(guó))提取試劑說(shuō)明提取總RNA，并檢測(cè)RNA濃度。對(duì)于miR-143-5p，使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR211，TIANGEN)生成cDNA。U6作為內(nèi)參對(duì)照，所有結(jié)果利用2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：AGS、HGC細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按照1×103/孔的濃度接種至6孔培養(yǎng)板。給予轉(zhuǎn)染miR-143-5p antagomir/angomir、缺氧等干預(yù)處理，更換培養(yǎng)基并觀察，待發(fā)現(xiàn)有肉眼可見(jiàn)的白色小點(diǎn)狀細(xì)胞集落，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞集落，PBS清洗3次后經(jīng)無(wú)水乙醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min后在倒置顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞集落，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，共重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：待培養(yǎng)板中AGS、HGC細(xì)胞生長(zhǎng)為30%～50%時(shí)，更換只含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，按照轉(zhuǎn)染試劑盒指示使用Lipofectamine 2000將miR-143-5p angomir/antagomir(50 nmol/L)、Control miRNA(50 nmol/L)(Thermo Fisher，美國(guó))、野生型及突變型pcDNA 3.1 SMDT1(武漢巴菲特生物技術(shù)公司合成)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，48 h后更換含10% FBS、雙抗的培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%時(shí)收集細(xì)胞，并通過(guò)RT-PCR、免疫印跡法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：采用TOPglow/FOPglow TCF報(bào)告試劑盒(17-366，UPSTATE，美國(guó))，70%貼壁生長(zhǎng)的HGC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Control miRNA、miR-143-5p、野生型pcDNA3.1 SMDT1質(zhì)粒后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再對(duì)轉(zhuǎn)染miR-143-5p angomir的細(xì)胞中轉(zhuǎn)入突變型pcDNA3.1 SMDT1。依據(jù)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明手冊(cè)采用0.2 g/孔濃度轉(zhuǎn)染TOPglow、FOPglow報(bào)告質(zhì)粒，設(shè)置復(fù)孔，經(jīng)細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞，用熒光素檢測(cè)儀分析Firely Lcuiferase熒光值(TOP)和Renilla Luciferase熒光值(FOP)，計(jì)算TOP/FOP的比值。

1.2.6 免疫印跡：使用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，包括蛋白酶抑制劑混合物(P1005，碧云天生物科技公司)。通過(guò)SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶封閉后，膜在4 ℃與一抗反應(yīng)過(guò)夜：CD81(1∶2 000)，TSG101(1∶1 000)，CD9(1∶1 000)，抗SMDT1(1∶1 000)、抗GAPDH(1∶5 000)。HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下將膜孵育2 h溫度。洗滌膜并在室溫下孵育1 h HRP偶聯(lián)的二抗。蛋白質(zhì)是使用Bio-Rad ChemiDoc XRS+系統(tǒng)檢測(cè)采集。

1.2.7 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過(guò)處理后的細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%～90%時(shí)，移液器200 ml槍頭尖端橫穿細(xì)胞表面形成劃痕傷口。PBS溶液洗3次去掉懸浮的細(xì)胞，并在37 ℃常氧、缺氧培養(yǎng)箱中孵育48 h，傷口處的細(xì)胞遷移48 h后對(duì)前面進(jìn)行拍照。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。傷口面積使用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞分泌外泌體的提取、鑒定胃癌細(xì)胞AGS、HGC通過(guò)無(wú)外泌體培養(yǎng)基在常氧、缺氧(體積分?jǐn)?shù)為1%的O2)條件下培養(yǎng)48 h，分離并提取細(xì)胞培養(yǎng)液中的外泌體。胃癌細(xì)胞分泌的外泌體呈圓形顆粒范圍為30～150 nm，無(wú)論缺氧、常氧條件下，HGC、AGS細(xì)胞的外泌體中均富含外泌體標(biāo)記蛋白CD81、TSG101和CD9(見(jiàn)圖1A～1B)，該結(jié)果證明我們有效地分離了外泌體。PKH67熒光試劑標(biāo)記的外泌體與HGC細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中孵育2 h后被內(nèi)吞攝取(見(jiàn)圖1C)。

注：A：電子顯微鏡分析外泌體的形態(tài)和大??；B：HGC、AGS細(xì)胞外泌體中標(biāo)記蛋白CD81、TSG101和CD9蛋白的表達(dá)；C：免疫熒光顯示HGC細(xì)胞內(nèi)吞PKH67標(biāo)記的外泌體(綠色)(放大200倍)。

2.2 缺氧胃癌細(xì)胞外泌體促進(jìn)常氧細(xì)胞的侵襲、增殖為了明確缺氧條件下胃癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)常氧胃癌細(xì)胞的影響，我們通過(guò)外泌體與胃癌細(xì)胞的共培養(yǎng)，分析癌細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞克隆形成。缺氧條件下AGS、HGC細(xì)胞外泌體與常氧細(xì)胞相比，外泌體共培養(yǎng)中顯著促進(jìn)AGS、HGC細(xì)胞克隆形成、細(xì)胞增殖(P<0.01，見(jiàn)圖2A)。在劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中，缺氧AGS、HGC細(xì)胞的外泌體比常氧AGS、HGC細(xì)胞外泌體具有更強(qiáng)的促癌細(xì)胞劃痕愈合、運(yùn)動(dòng)能力(P<0.01，見(jiàn)圖2B)。GW4869可有效阻斷細(xì)胞外泌體釋放。缺氧AGS、HGC細(xì)胞衍生的外泌體在添加GW4869后，細(xì)胞克隆形成活力明顯受抑制，劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移、侵襲能力下降顯著(P<0.01，見(jiàn)圖2C～2D)。結(jié)果表明缺氧誘導(dǎo)下胃癌細(xì)胞分泌外泌體能夠高效地促進(jìn)常氧細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

注：分離胃癌HGC、AGS細(xì)胞在缺氧、常氧條件下的外泌體，再將外泌體與HGC、AGS細(xì)胞進(jìn)行常氧共培養(yǎng)。A：克隆形成實(shí)驗(yàn)分析外泌體對(duì)常氧AGS、HGC細(xì)胞的增殖影響；B： 細(xì)胞劃痕后48 h，分析外泌體對(duì)常氧AGS、HGC細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)影響；C～D： 缺氧胃癌細(xì)胞外泌體在添加GW4869后，轉(zhuǎn)染HGC、AGS細(xì)胞，顯示了細(xì)胞克隆形成、劃痕愈合(48 h)的變化。放大200倍；**P<0.01。

2.3 缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的外泌體富集miR-143-5pmiRNA被包裹在腫瘤細(xì)胞的外泌體，并通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移至新的癌細(xì)胞，最終在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、化療耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[11]。證據(jù)表明miR-143-5p在肺癌[15]、膽囊癌[10]和胰腺癌[16]的惡性進(jìn)展中擔(dān)當(dāng)癌基因角色，胃癌中我們也證實(shí)了miR-143-5p的異常高表達(dá)。首先，我們通過(guò)在線腫瘤研究數(shù)據(jù)庫(kù)Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)發(fā)掘了miR-143-5p在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，而且以對(duì)數(shù)秩采用Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)miR-143-5p的高表達(dá)與胃癌患者的整體不良預(yù)后有顯著相關(guān)性(見(jiàn)圖3A～3B，P<0.01)。miR-143-5p是否參與缺氧條件下胃癌細(xì)胞侵襲、增殖的調(diào)控？

進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR分析，我們發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下AGS、HGC細(xì)胞外泌體與常氧胃癌細(xì)胞外泌體比較，miR-143-5p水平顯著升高(P<0.01，見(jiàn)圖3C)。缺氧誘導(dǎo)的miR-143-5p能否通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移至其他胃癌細(xì)胞？我們將缺氧AGS、HGC外泌體分別與AGS、HGC細(xì)胞在常氧下共培養(yǎng)，受體細(xì)胞中miR-143-5p表達(dá)也顯著增加，并且添加GW4869后能夠有效抑制受體胃癌細(xì)胞AGS、HGC中miR-143-5p的過(guò)表達(dá)(P<0.01，見(jiàn)圖3D)，這表明缺氧誘導(dǎo)的高水平miR-143-5p是大量通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移至受體癌細(xì)胞。此外，為排除受體細(xì)胞自身miRNA合成的影響，我們加入RNA聚合酶Ⅱ的處理，該抑制劑不影響缺氧胃癌細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)受體AGS、HGC細(xì)胞內(nèi)miR-143-5p的增加，表明外泌體介導(dǎo)的miRNA轉(zhuǎn)移引起受體細(xì)胞miR-143-5p的增加，而不是內(nèi)源性miR-143-5p反應(yīng)(P<0.01，見(jiàn)圖3E)。正如我們觀察到的，受體細(xì)胞中miR-143-5p上調(diào)基本是依賴缺氧胃癌細(xì)胞分泌的外泌體轉(zhuǎn)移表達(dá)。

注：A：通過(guò)在線Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)，分析胃癌組織與癌旁正常胃組織中miR-143-5p的表達(dá)水平；B：Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)中在線分析miR-143-5p與胃癌患者預(yù)后關(guān)系；C：RT-PCR分析缺氧干預(yù)下胃癌細(xì)胞HGC、AGS分泌的外泌體中miR-143-5p表達(dá)差異；D：分離缺氧誘導(dǎo)后HGC、AGS細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體，外泌體分別轉(zhuǎn)染常氧HGC、AGS細(xì)胞，并給予GW4869阻斷外泌體釋放，通過(guò)RT-PCR評(píng)估轉(zhuǎn)染后常氧HGC、AGS細(xì)胞的miR-143-5p水平變化；E：RNA聚合酶Ⅱ抑制劑不影響受體HGC細(xì)胞中外泌體促miR-143-5p的增加。SD：誤差線。NS：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**P<0.01。

2.4 缺氧條件胃癌細(xì)胞分泌的外泌體轉(zhuǎn)移miR-143-5p促進(jìn)常氧胃癌細(xì)胞的侵襲、增殖上述我們探討了缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞外泌體中miR-143-5p的高表達(dá)及細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，后續(xù)在外泌體與HGC細(xì)胞共培養(yǎng)中我們使用miR-143-5p antagomir模擬物轉(zhuǎn)染。缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞HGC中過(guò)表達(dá)的miR-143-5p被miR-143-5p antagomir所抑制，圖4A展示了不同干預(yù)條件下HGC細(xì)胞外泌體中miR-143-5p水平，miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染顯著抑制了缺氧誘導(dǎo)的HGC細(xì)胞外泌體的miR-143-5p過(guò)表達(dá)(P<0.01)。

HGC細(xì)胞給予缺氧刺激、miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染干預(yù)，并分離其外泌體后將其與HGC細(xì)胞在常氧下進(jìn)行共培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞克隆增殖實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，相比較缺氧誘導(dǎo)的HGC細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)高效促進(jìn)HGC細(xì)胞的克隆增殖，miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染后再缺氧刺激來(lái)源的外泌體并不能有效促進(jìn)HGC細(xì)胞在常氧下的增殖增加(P<0.01，見(jiàn)圖4A)。同樣的，在劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中，我們同樣觀察到缺氧誘導(dǎo)的HGC細(xì)胞外泌體明顯增加常氧下HGC細(xì)胞的劃痕愈合速度，miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染能夠有效阻斷缺氧誘導(dǎo)的HGC細(xì)胞外泌體對(duì)劃痕愈合的影響(見(jiàn)圖4B)。上述結(jié)果說(shuō)明，缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的miR-143-5p的高表達(dá)，通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移并促進(jìn)其他癌細(xì)胞的增殖、侵襲。

注：A：miR-143-5p antagomir抑制常氧、缺氧胃癌HGC細(xì)胞中外泌體miR-143-5p表達(dá)；B～C:收集經(jīng)miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染、缺氧處理后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中外泌體，并將外泌體轉(zhuǎn)染至常氧HGC、AGS細(xì)胞；miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染后外泌體能夠抑制受體HGC、AGS細(xì)胞克隆形成(B)、細(xì)胞劃痕愈合(C)。SD：誤差線；**P<0.01。

2.5 缺氧誘導(dǎo)外泌體轉(zhuǎn)移miR-143-5p下調(diào)SMDT1促進(jìn)常氧胃癌細(xì)胞惡性進(jìn)展為更進(jìn)一步探索外泌體miR-143-5p過(guò)表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的分子機(jī)制，我們?cè)诰€預(yù)測(cè)了miR-143-5p下游靶基因。通過(guò)三個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan、miRanda和miRDB)的分析，發(fā)現(xiàn)SMDT1基因是miR-143-5p的靶基因，并預(yù)測(cè)了其結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖5A)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的分析表明，缺氧誘導(dǎo)HGC細(xì)胞分泌的外泌體和miR-143-5p angomir轉(zhuǎn)染均能夠抑制野生型SMDT1 3′-UTR報(bào)告基因的螢光素酶活性，而對(duì)突變型SMDT1 3′-UTR報(bào)告基因的螢光素酶活性無(wú)影響(P<0.01，見(jiàn)圖5B～5C)。而且，免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-143-5p angomir能夠顯著抑制SMDT1蛋白的表達(dá)，而miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染HGC、AGS細(xì)胞后再給予缺氧誘導(dǎo)，其外泌體轉(zhuǎn)移對(duì)常氧HGC、AGS細(xì)胞SMDT1蛋白的表達(dá)無(wú)影響(見(jiàn)圖5D)。上述結(jié)果表明缺氧誘導(dǎo)miR-143-5p上調(diào)，外泌體介導(dǎo)miR-143-5p轉(zhuǎn)移抑制SMDT1基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。

SMDT1在腫瘤的調(diào)控中主要通過(guò)PI3K/Akt途徑，我們推測(cè)缺氧的外泌體介導(dǎo)的miR-143-5p可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。常氧胃癌HGC細(xì)胞的PI3K/Akt的磷酸化通過(guò)免疫印跡分析，缺氧誘導(dǎo)的外泌體共培養(yǎng)能夠明顯上調(diào)PI3K、Akt的磷酸化，而HGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143-5p antagomir抑制miR-143-5p水平及下調(diào)的PI3K、Akt磷酸化(見(jiàn)圖5G)。這些結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)的外泌體miR-143-5p高表達(dá)通過(guò)激活PI3K/Akt磷酸化促進(jìn)胃癌進(jìn)展。加入PI3K抑制劑LY294002，阻斷PI3K/Akt通路，最終阻斷miR-143-5p angomir模擬物、缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞AGS、HGC的細(xì)胞克隆增殖和劃痕愈合(見(jiàn)圖5E～5F，P<0.01)。

注：A：SMDT1 3′ UTR與miR-143-5p預(yù)測(cè)結(jié)合的示意圖，突變發(fā)生在預(yù)測(cè)的miR-143-5p結(jié)合位點(diǎn)；B～C：缺氧和miR-143-5p angomir作用下SMDT1 3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因分析；D：miR-143-5p angomir和缺氧干預(yù)后的HGC細(xì)胞，其外泌體轉(zhuǎn)移抑制常氧HGC細(xì)胞中SMDT1蛋白的表達(dá)；miR-143-5p antagomir能夠逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的外泌體對(duì)常氧細(xì)胞SMDT1蛋白表達(dá)的抑制作用；E～F：HGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143-5p angomir或antagomir，再給予缺氧或常氧處理，最后提取的外泌體與常氧HGC細(xì)胞共培養(yǎng)。細(xì)胞克隆形成(E)及劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(F)發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑(LY294002)可阻斷缺氧誘導(dǎo)的AGS、HGC細(xì)胞外泌體或miR-143-5p angomir轉(zhuǎn)染對(duì)常氧AGS、HGC細(xì)胞增殖、侵襲的促進(jìn)作用；G：免疫印跡分析，miR-143-5p antagomir轉(zhuǎn)染能夠抑制缺氧HGC細(xì)胞外泌體對(duì)常氧HGCLAMP3信號(hào)軸異常激活促進(jìn)了食管癌的上皮細(xì)胞上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化、化療耐藥的發(fā)生；miR-143-5p在外周血中的高表達(dá)可作為結(jié)直腸癌可靠的臨床診斷標(biāo)志物[12，23-24]。本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞在缺氧條件下通過(guò)miR-143-5p/SMDT1、PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控胃癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展，而且胃癌組織中miR-143-5p呈現(xiàn)明顯高表達(dá)。細(xì)胞PI3K和AKT的磷酸化的激活作用；SD：誤差線；**P<0.01。

3 討論

缺氧是腫瘤微環(huán)境的特征之一，已經(jīng)被證實(shí)是多種實(shí)體腫瘤惡性進(jìn)展和化療藥物耐藥發(fā)生的主要驅(qū)動(dòng)力[17]。外泌體參與胃癌多種惡性進(jìn)展的調(diào)控，但外泌體是否參與缺氧調(diào)控腫瘤進(jìn)展的機(jī)制尚未得到很好的闡明。有研究強(qiáng)調(diào)了缺氧在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞外泌體分泌方面的重要作用[18]。缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞衍生新生血管生成[19]，減少腫瘤細(xì)胞間粘附而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[17]。

我們發(fā)現(xiàn)缺氧胃癌細(xì)胞的外泌體促進(jìn)常氧胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。有研究也發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞分泌的外泌體被常氧細(xì)胞同化，并引起受體細(xì)胞發(fā)生EMT表型轉(zhuǎn)化[20]。與以前的研究相似，腫瘤微環(huán)境的重要組成部分包括外泌體，該外泌體具有在細(xì)胞-細(xì)胞之間交換信號(hào)的作用，并且缺氧區(qū)域的腫瘤細(xì)胞可以將外泌體遞送至正常氧區(qū)域的周圍腫瘤細(xì)胞，從而這些受體細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的惡性侵襲、增殖。目前有種假說(shuō)，認(rèn)為外泌體的血漿水平可能作為獨(dú)立的腫瘤生物標(biāo)志物[21]，這也是本次研究欠缺的方面，總之，針對(duì)腫瘤微環(huán)境和腫瘤缺氧的治療是未來(lái)抗癌策略一種可行的方法。

較少研究來(lái)闡明通過(guò)缺氧誘導(dǎo)的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)非編碼RNA分子的功能和潛在調(diào)控機(jī)制。值得注意的是，缺氧微環(huán)境可能會(huì)影響源自腫瘤細(xì)胞的外泌體中miRNA的表達(dá)，而外泌體miRNA在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。例如，來(lái)自結(jié)腸癌細(xì)胞的外泌體miR-25-3p通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展，并且可以用作臨床預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移診斷的生物標(biāo)志物[22]。已知多種癌組織中觀察到異常的miR-143表達(dá)，提示miR-143具有廣泛的促癌作用。miR-143-5p與HUG1基因的異常調(diào)控參與骨肉瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展；miR-143-5p/

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)缺氧促進(jìn)胃癌細(xì)胞外泌體釋放，并且高表達(dá)外泌體miR-143-5p。這些富含miR-143-5p的外泌體被正常氧環(huán)境胃癌細(xì)胞內(nèi)吞，抑制SMDT1后介導(dǎo)PI3K/Akt途徑促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。這提示靶向外泌體或miR-143-5p可能是對(duì)抗胃癌的潛在治療方向。