膽汁酸與腸道菌群在腸道疾病中的研究進展

侯 康， 李蘇艷， 宋丹琳， 趙 月， 陳 思， 鄒 珂， 李凱園， 褚傳蓮，5

1.山東大學，山東 濟南 250012； 2.濰坊醫(yī)學院； 3.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)； 4.山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院保健消化科； 5.濟南市胃腸疾病轉(zhuǎn)化重點實驗室，濟南市消化疾病臨床研究中心

人類胃腸道聚集了100萬億以上的微生物，包括細菌、病毒、真菌等，其中細菌中95%為雙歧桿菌和乳酸菌，其在結腸中的密度最大，估計1011～1012個/ml[1-3]，腸道細菌影響膽汁酸去結合、共價修飾和異構化，膽汁酸也能夠通過多種方式影響腸道菌群的組成和數(shù)量。現(xiàn)證實膽汁酸-腸道菌群與多種疾病有關。結直腸癌(colorectal cancer，CRC)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、糖尿病、非酒精性脂肪肝、膽汁淤積性肝病、阿爾茲海默癥、肝性腦病、代謝紊亂等均有膽汁酸-腸道菌群的參與。本文闡述膽汁酸與腸道菌群的相互關系，介紹膽汁酸-腸道菌群參與CRC、IBD發(fā)生發(fā)展機制，為解決臨床疾病提供參考。

1 膽汁酸代謝對腸道菌群的影響

1.1 膽汁酸代謝直接影響腸道菌群的構成及豐度研究[4]發(fā)現(xiàn)，給予Apcmin/+小鼠脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)處理，DCA可使腸道菌群F/B值升高，改變其腸道菌群組成，大腸桿菌、志賀菌等機會致病菌水平顯著升高，而乳桿菌等益生菌豐度降低。這表明膽汁酸可改變腸道菌群的組成。膽汁酸還可直接抑制腸道菌群。膽汁酸作為雙親性分子，具有親脂性和親水性，可破壞磷脂雙分子層，引起細胞膜破裂，最終導致細胞死亡[5]。膽汁酸能夠通過自由擴散，進入革蘭氏陰性菌細胞內(nèi)，引起細胞發(fā)生應激反應，誘導細胞RNA形成二級結構，或?qū)е聼釕ば菘说鞍椎确肿影閭H變性而失去正常功能，最終導致菌體內(nèi)新合成蛋白質(zhì)無法正常折疊，導致細菌死亡[6-7]。疏水性DCA的抗菌效力是膽酸(cholic acid,CA)的10倍，因為疏水性膽汁酸對細菌細胞膜磷脂雙分子層的親和力更高，故對細胞膜完整性的損傷更大。膽汁酸可氧化損傷DNA，激活DNA相關修復酶[8]；與細菌內(nèi)外的鈣離子和亞鐵離子等重要離子螯合，可以影響細菌的基因表達，及抑制細菌運動、繁殖和趨化[8-9]。

1.2 膽汁酸對腸道菌群的間接作用膽汁酸間接影響腸道菌群主要是通過法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)實現(xiàn)。FXR調(diào)節(jié)膽汁酸生成、分泌及代謝。FXR表達最多的是肝臟、回腸和腎臟。肝臟FXR被膽汁酸激活，誘導小異二聚體伴侶(SHP)分子的表達，SHP與肝受體同源蛋白-1(LRH-1)結合，抑制Cyp7A1基因的表達[10]。Cyp7A1是膽汁酸經(jīng)典合成途徑的限速酶，決定膽汁酸合成的量，在正常條件下至少75%的膽汁酸通過經(jīng)典合成途徑產(chǎn)生。在回腸中，F(xiàn)XR誘導小鼠成纖維細胞生長因子FGF15(人類為FGF19)表達，F(xiàn)GF15/19經(jīng)門靜脈到達肝臟，肝臟中FGF受體4(FGFR4)/b-klotho異二聚體復合物與其結合，觸發(fā)JNK1/2和ERK1/2信號級聯(lián)反應，導致Cyp7A1及Cyp8B1(參與膽汁酸合成)的表達受到抑制，膽汁酸合成下降[10-11]。FXR也通過調(diào)節(jié)膽鹽輸出泵(BSEP)和多藥耐藥性相關蛋白2(MRP2)轉(zhuǎn)運體的表達控制膽汁酸的分泌。在膽汁酸刺激下，F(xiàn)XR通過作用SHP，抑制結腸細胞頂膜鈉依賴性膽鹽轉(zhuǎn)運體(ASBT)的啟動子的激活[12]；FXR可以激活回腸中膽汁酸結合蛋白(ileal bile acid binding protein，IBABP)促進膽汁酸鹽從腸細胞的頂端移動到基底外側(cè)膜，從而加速膽汁酸重吸收回肝臟，并通過誘導回腸上皮細胞異二聚體轉(zhuǎn)運蛋白OSTa/OSTb的表達使膽汁酸釋放到門靜脈循環(huán)中以返回肝臟[13]。膽汁酸抵達肝臟處被肝細胞竇狀隙膜的鈉依賴的?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽(NTCP)，少量被有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋(OATP)家族(OATP1和OATP4)攝取[14]，這2種轉(zhuǎn)運體受到FXR的負反饋調(diào)節(jié)，表面肝臟內(nèi)膽汁酸含量過高；當肝臟發(fā)生炎癥時，F(xiàn)XR減少，NTCP及OATP受到負反饋調(diào)節(jié)，增加膽汁流入。

對FXR基因敲除小鼠和野生型小鼠使用非甾體類FXR激動劑(GW4064)預處理，然后進行膽道結扎，結果顯示，兩組均表現(xiàn)為腸道菌群紊亂及腸黏膜破壞，繼續(xù)使用FXR激動劑處理，野生型小鼠體內(nèi)FXR相關基因表達增加，腸道細菌的豐度降低；而FXR基因敲除小鼠不會出現(xiàn)上述改變，提示膽汁酸可通過激活FXR，抑制腸道菌群的過度生長，避免腸道黏膜破壞。鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)和熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)可分別通過激活FXR和維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)誘導內(nèi)源性抑菌肽的表達，進而防止細菌對腸道上皮的侵害[15]。VDR主要作為腸道膽汁酸感受器，可被石膽酸(lithocholic acid，LCA)激活。對結腸癌小鼠補充維生素D后，小鼠膽汁酸水平明顯改善，肝內(nèi)CYP7A1的mRNA水平逐漸降低趨于正常[16]。這是由于VDR可以激活SD大鼠ASBT基因的表達，上調(diào)腸道中FGF15的表達，促進了回腸膽汁酸的轉(zhuǎn)運，導致小鼠肝臟CYP7A1的活性降低，膽汁酸合成減少，發(fā)揮穩(wěn)定膽汁酸代謝作用[17]。

2 腸道菌群對膽汁酸的影響

腸道菌群對膽汁酸的合成、代謝均有影響。腸道菌群對膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化作用以解離和脫羥基作用為主，最終生成次級膽汁酸，參與解離、脫羥基的菌群調(diào)節(jié)次級/初級膽汁酸比例；類桿菌、梭狀芽孢桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌和李斯特氏菌可以產(chǎn)生膽汁鹽水解酶(BSH)，去除甘氨酸或?；撬峋Y合物發(fā)揮去結合作用[13]。脫去甘氨酸和?；撬岬哪懼?，由細菌與膽汁酸誘導的基因進行多重反應最終脫下7-脫羥基成為次級膽汁酸，能夠產(chǎn)生次級膽汁酸的細菌屬于梭菌屬(ⅩⅣa和Ⅺ簇)和真桿菌屬[18]，均屬于厚壁菌門。實驗發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠接受普通小鼠或人類的糞菌移植(fecal microbiota transplanta-tion,FMT)后，腸上皮FXR表達上調(diào)，F(xiàn)XR進一步誘導FGF15表達，進而抑制CYP7A1、CYP8B1等酶的活性，從而抑制膽汁酸的合成[18-19]。給予小鼠抗生素可抑制其回腸FGF15表達，肝臟CYP7a1表達水平及其活性升高導致膽汁酸合成較前明顯增多。劉宏偉等[20]對肥胖小鼠應用狄氏副擬桿菌(Parabacteroides distasonis)治療，發(fā)現(xiàn)狄氏副擬桿菌具有膽酸轉(zhuǎn)化功能，能夠水解多種結合型膽汁酸，將初級膽汁酸轉(zhuǎn)化為多種次級膽酸(LCA、UDCA等)，同時產(chǎn)生大量琥珀酸。LCA等次級膽酸通過激活腸道FXR信號通路，使小鼠血清及結腸中FGF15水平升高，肝臟中Cyp7a1水平下降；UDCA可以修復腸壁完整性，琥珀酸改善宿主糖代謝紊亂。

G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(G protein-coupled bile acid receptor 5,TGR5)也可被腸道菌群激活，從而抑制膽汁酸合成[13]。TGR5是一種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，既往發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，高脂飲食的缺乏TGR5基因小鼠膽汁酸池大小減少21%～25%，體脂積累增加，體質(zhì)量增加。腸道細菌還能夠通過不斷刺激腸道上皮細胞，導致上皮細胞中心肌轉(zhuǎn)錄因子4(GATA4)的表達，ABST的表達受到抑制，導致膽汁酸在回腸末端的重吸收減少[21]。

3 膽汁酸-腸道菌群與腸道疾病

3.1 膽汁酸-腸道菌群與CRCCRC是占全球發(fā)病和死亡首位的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球居于惡性腫瘤第3位，死亡率高居第2位[22]，而在我國分別位于我國惡性腫瘤的第4位和第5位[23]。腸道菌群的失調(diào)及次級膽汁酸的升高被認為與結腸癌發(fā)生有關。有研究發(fā)現(xiàn)，給予DCA喂養(yǎng)的小鼠腸道菌群組成發(fā)生改變，并伴有腸屏障受損、腸道低度炎癥和腺瘤—癌癥進展，與普通喂養(yǎng)的小鼠有明顯差異，將糞便微生物群從DCA處理的小鼠轉(zhuǎn)移到另一組正常小鼠，增加了腫瘤的多樣性，誘導了炎癥，激活了腫瘤相關的Wnt/β-catenin信號通路；隨后的研究發(fā)現(xiàn)由抗生素的雞尾酒消耗的微生物群足以阻斷DCA誘導的腸道癌變，提示DCA引起的微生物群落的改變，共同促進腸道癌變[24]。

次級膽汁酸引發(fā)CRC涉及多種機制。次級膽汁酸刺激Wnt與低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)-卷曲受體(FZR)-E-鈣黏蛋白-β-連環(huán)蛋白復合物的結合，導致β-連環(huán)蛋白從E-鈣黏蛋白釋放并進入細胞質(zhì)，然后移位到細胞核并刺激轉(zhuǎn)錄因子，如Lef/TCF，促進細胞增殖和細胞干細胞，從而促進大腸癌的發(fā)生發(fā)展。次級膽汁酸可以激活表皮生長因子受體(EGFR)、釋放花生四烯酸(AA)釋放到細胞質(zhì)中、刺激NADP(H)氧化酶等增加活性氧(ROS)產(chǎn)生，ROS可引起DNA損傷及炎癥，誘導細胞癌變。此外ROS也可以導致促炎細胞因子IL-1β表達上調(diào)并激活NF-κB[13]。膽汁酸還可以激活蛋白激酶C(PKC)，進而激活NF-κB通路，激活的NF-κB轉(zhuǎn)錄編碼IL-1β的基因，IL-1β阻斷p53活性，p53的減少導致細胞凋亡減少[13]。膽汁酸可以激活EGFR，進而激活Ras-ERK1/2信號通路，最終導致靶基因c-myc的轉(zhuǎn)錄，促進細胞增殖和干細胞分化[25]。

DCA可誘導腸道菌群失調(diào)并產(chǎn)生有害菌群，影響結腸癌的發(fā)生發(fā)展。喂食DCA小鼠可出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)、有害菌群增加及有益菌的減少[24]。腸道菌群失調(diào)可導致慢性炎癥、腸道通透性增加，進而誘發(fā)免疫反應、激活炎性因子的導致癌癥發(fā)生發(fā)展[26]。腸道生物失調(diào)會導致微生物群產(chǎn)生未結合膽汁酸和次級膽汁酸的能力減弱，這些膽汁酸是激活FXR的高親和力配體。FXR在mRNA水平上在結腸息肉中表達降低，在結腸腺癌中的表達更明顯。FXR表達缺失可導致Apcmin/+小鼠早期死亡率增加，促進Wnt信號通路活化并產(chǎn)生TNF-α，從而促進腫瘤發(fā)展。因此，通過控制腸道菌群失調(diào)，恢復FXR活力，建立完整的膽汁酸腸肝循環(huán)，有助于腸道腫瘤的控制。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加DCA組小鼠的條件致病菌如瘤胃球菌、梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌、脫硫弧菌、DOREA等均明顯升高，乳酸桿菌、乳球菌、薔薇酸菌相對較少[24]。其中大腸桿菌菌株能合成各種毒力因子，毒力因子具有遺傳毒性和調(diào)節(jié)細胞周期進展、增殖、分化和凋亡，還可誘導人DNA雙鏈的斷裂和染色體不穩(wěn)定的發(fā)生促進大腸癌的發(fā)生[26]。有研究表明，核梭狀芽孢桿菌通過其FadA黏附素調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白信號傳導來促進CRC發(fā)生[27]。最近發(fā)現(xiàn)腸道菌可影響阿司匹林對大腸癌的預防作用[28]，喂食阿司匹林后小鼠中有益菌(雙歧桿菌和乳酸桿菌)增加，致病菌(Alistipes finegoldii和脆弱擬桿菌)減少。發(fā)現(xiàn)阿司匹林可抑制接受過抗生素處理的腫瘤發(fā)生發(fā)展，腸道菌群中的球形芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus)可降解阿司匹林，消除阿司匹林通過改善腸道菌群而發(fā)揮的抗癌作用。值得一提的是，針對腫瘤好發(fā)于結腸而不是小腸中，研究者將突變型p53基因引入到WNT驅(qū)動的腸癌小鼠中，發(fā)現(xiàn)十二指腸和空場未見腫瘤生長，突變型p53發(fā)生超強抑癌作用；而在結腸和空腸中突變型p53與轉(zhuǎn)錄因子TCF4結合，激活Wnt通路，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，使結腸和回腸出現(xiàn)高度發(fā)育不良和增生，這是因為腸道菌群中特定菌群(乳桿菌和枯草芽孢桿菌)代謝出抗氧化物質(zhì)——沒食子酸導致腸癌的發(fā)生[29]，這與以往抗氧化預防抗腫瘤的認知不一致?？偠灾?，膽汁酸與腸道菌群之間關系密切，并可以通過相互作用影響，在一定條件下相互促進導致CRC的發(fā)生。

3.2 膽汁酸-腸道菌群與IBD作為一種病因和發(fā)病機制未明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，IBD的發(fā)生可能是感染、環(huán)境、遺傳、免疫等相互作用的結果。膽汁酸-腸道菌群的失衡破壞宿主物質(zhì)代謝及信號傳導，現(xiàn)認為參與IBD的發(fā)生。TGR5與膽汁酸存在負性調(diào)控，主要由LCA和DCA激活。TGR5選擇性激動劑能維持腸上皮屏障的完整性，減輕腸道異常免疫反應[30]。研究顯示，膽汁酸可以激活TGR5-cAMP-CREB通路，抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激巨噬細胞分泌細胞因子，減少巨噬細胞向分泌IL-12的樹突細胞分化[31]；激活TGR5能抑制NF-κB，減少炎癥因子IL-8基因表達，誘導的IL-10等細胞因子分泌，進而發(fā)揮抗炎效應[32]，以上均提示TGR5可能在炎癥性腸病中發(fā)揮保護作用。腸道發(fā)生炎癥時腸道屏障受損，導致FXR的表達降低，最終破壞腸肝循環(huán)使膽汁酸積聚在腸黏膜，腸道炎癥加重。激活FXR可改善動物結腸炎癥，對動物的腸道炎癥具有保護作用，使腸道通透性降低，減少杯狀細胞消亡；FXR的激活還可抑制IBD患者黏膜細胞分泌TNF-α、干擾素(IFN)-γ、IL-17等炎性細胞因子，上調(diào)腸道中抗炎因子IL-10表達[33]。研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者腸道維生素D代謝失衡，血清25-羥維生素D水平降低，VRD表達下調(diào)，炎癥細胞(如單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及活化的T/B淋巴細胞)的VRD的水平較高，這表明VRD可能參與IBD炎性細胞的分化及功能[34]。最近有研究表明，膽汁酸經(jīng)菌群代謝后的產(chǎn)物等能調(diào)節(jié)腸道RORγ+調(diào)節(jié)性T細胞穩(wěn)態(tài)，且腸道膽汁酸池恢復后增加了結腸RORγ+Treg細胞的數(shù)量，膽汁酸-VRD維持RORγ+調(diào)節(jié)性T細胞在葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導的結腸炎中發(fā)揮保護作用[35]。

研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者腸道菌群失調(diào)，厚壁菌門、擬桿菌門菌群數(shù)量下降[36]，引發(fā)的腸腔內(nèi)次級膽汁酸減少，3-OH硫化次級膽汁酸含量增加，次級膽汁酸的減少會減弱對腸道上皮細胞的保護作用，同時3-OH硫化次級膽汁酸的增加減弱了次級膽汁酸的抗炎作用，可能使IBD惡化[37]。

FMT作為新型的治療方法能重建腸道菌群，改變引起自身免疫反應的因素，在治療IBD中備受關注。通過FMT將供體糞便移植導入IBD患者，不僅可以糾正菌群失調(diào)，增加正常腸道微生物數(shù)量，從腸道中競爭獲取營養(yǎng)物質(zhì)，抑制病原微生物的生長，還可以恢復腸壁功能[38]。目前發(fā)現(xiàn)在患者接受FMT 3個月后，腸道中的擬桿菌由原來的7%上升至41%，擬桿菌通過誘導潘氏細胞合成抗菌蛋白，增強溶菌酶的抗菌活性，擬桿菌還參與誘導轉(zhuǎn)錄因子血管生成素-3，可以促進腸黏膜的發(fā)育及腸道微血管的形成，可見通過FMT可以維持腸壁屏障功能[39-40]。進行FMT可以改變體內(nèi)膽汁酸組成，影起FXR受體及FGF水平變化[41]。對肥胖或高脂飲食小鼠進行FMT后發(fā)現(xiàn)，CA及DCA水平下降，下調(diào)色氨酸羥化酶1(TPH1)表達，進而降低腸道5-羥色胺水平[42]，5-羥色胺能夠抑制腸道共生菌生長、抑制腸道上皮β防御素的產(chǎn)生及加重腸道炎癥[43]。

4 結語與期望

膽汁酸的合成、代謝是一個復雜過程，不僅在肝內(nèi)受到多種酶的影響，而且膽汁酸相關受體更參與膽汁酸的代謝，隨著對腸道菌群研究的深入，腸道菌群也參與膽汁酸池的調(diào)控，膽汁酸與腸道菌群之間的關系越來越明確。膽汁酸本身可以影響腸道菌群的比例及數(shù)量，通過膽汁酸相關受體對腸道菌群也有間接影響。膽汁酸-腸道菌群在腸道疾病中的研究越來越受到重視。次級膽汁酸本身可通過多種機制參與CRC的發(fā)展，還可以引起腸道菌群失調(diào)，導致有害菌群增加、形成腸道慢性炎癥。膽汁酸相關受體及腸道菌群失調(diào)現(xiàn)認為也與IBD的產(chǎn)生有關，其中FMT可以明顯緩解IBD患者病情。隨著對腸道菌群研究的深入，現(xiàn)在膽汁酸與腸道菌群的關系更加清晰，在參與發(fā)生CRC、IBD等方面取得了新的發(fā)現(xiàn)，為以后治療腸道相關疾病提供理論基礎，但要把研究成果應用到實際臨床上還需要更加深入的探討與研究。